Производство посадочного материала в УЗВ как единство селекции и технологии


Голод В.М., Терентьева Е.Г., Крупкин В.З.
ФГУП «Федеральный селекционно-генетический центр рыбоводства»,
Ропша, Россия
Аннотация
Федеральный селекционно-генетический центр рыбоводства (ФСГЦР),
расположенный в пригороде Санкт-Петербурга, является одним из крупных
поставщиков посадочного материала радужной форели на северо-западе России.


Основное направление деятельности предприятия – выведение пород рыб для
индустриального рыбоводства.
В последние годы здесь построено и введено в эксплуатацию пять установок
замкнутого водопотребления (УЗВ), охватывающих весь цикл выращивания форели от
формирования маточного стада до производства и реализации посадочного материала.
Высокое качество посадочного материала достигается сочетанием селекционной
работы и использования возможностей, предоставляемых УЗВ. В селекционной работе
сочетаются методы массового отбора и семейной селекции с использованием
близкородственных скрещиваний и оценки производителей по качеству потомства. В
результате налажен непрерывный цикл производства трех основных групп
посадочного материала: молоди средней массой 5-10 г, сеголеток массой 50-70 г и
годовиков - 100-300 г.
Ключевые слова: Радужная форель, посадочный материал, УЗВ, селекция
На протяжении многовековой истории человечества спрос на рыбу как
продукт питания удовлетворялся главным образом за счет лова в
естественных водоемах. Доля искусственного рыборазведения стала
существенной только к концу XX века, а в ближайшие годы роль
аквакультуры станет доминирующей. В рыбоводстве было создано
много различных форм выращивания рыбы, причем вновь возникшие
формы не заменяли старые, а часто существовали наряду с ними. В
связи с этой особенностью современное рыбоводство существует в
разнообразных формах, которые условно можно объединить в две
основные группы: пастбищное и индустриальное.
Особенностью индустриальной формы рыбоводства является
максимальная концентрация производства рыбы на малых площадях,
высокая механизация всех рыбоводных процессов и максимальная
мобилизация всех потенциальных возможностей организма рыбы для
достижения максимальной продуктивности. Высшей формой
12
индустриального рыбоводства является использование установок с
замкнутой системой водопотребления (УЗВ). В УЗВ предусматривается
полная биологическая очистка используемой воды и поддержание
температурного, кислородного, гидрологического и гидрохимического
режимов в пределах оптимума для объекта разведения.
Исследования и экспериментальные работы по созданию рыбоводных
ферм с замкнутым циклом водопотребления велись в СССР еще в 70-х
годах прошлого века. К сожалению, разработанные теоретические
основы этой технологии не получили практической реализации, а в
период распада СССР все экспериментальные установки были
утрачены. Интерес к рециркуляционным системам возродился только в
XXI веке. В настоящее время в России функционирует несколько
установок, на которых решаются локальные задачи. В тоже время, в
таких странах как США, Германия, Финляндия и Дания УЗВ широко
используются для крупномасштабного выращивания молоди и товарной
рыбы многих объектов рыбоводства (форель, осетровые, угорь, голец
и др.).
Водопотребление и водоотведение в УЗВ в сотни раз ниже, чем в
бассейновых хозяйствах с прямоточным водоснабжением. Это
значительно увеличивает количество водоисточников, пригодных для
организации рыбоводных хозяйств, позволяя сблизить места
производства и потребления рыбы. Снижение удельных затрат на
подогрев воды позволяет организовать круглогодичное выращивание
рыбы, многократно используя технологическое оборудование и
обеспечивая ритмичность поставки продукции потребителям, а
оптимизация режима выращивания позволяет снижать расход кормов на
единицу продукции. Незначительное водопотребление, в сочетании с
полной биологической и механической очисткой сточных вод, делает
УЗВ безопасными для окружающей среды.
Для ускоренного внедрения таких установок в России было решено
осуществить пилотный проект, который позволил бы изучить
особенности функционирования современных УЗВ в природно-
климатических и организационно-правовых условиях России,
разработать типовые проекты и наладить обучение персонала.
В качестве базы для выполнения такого проекта был выбран
Федеральный селекционно-генетический центр рыбоводства (ФСГЦР),
13
расположенный в поселке Ропша, ближайшем пригороде Санкт-
Петербурга. Данное предприятие, имеющее федеральный статус,
функционирует как самостоятельное с начала 90-х годов прошлого века.
Его основная задача – проведение селекционно-генетических
исследований, выведение пород рыб и производство посадочного
материала для товарных рыбоводных хозяйств. Однако, благодаря тому,
что ранее здесь располагалась экспериментальная база
Государственного научно-исследовательского института озерного и
речного рыбного хозяйства, коллективом центра накоплен большой
опыт и в других областях рыбоводной науки и практики.
В Ропшу радужная форель была завезена еще в конце 19 века.
Выращивали ее в малом объеме, она стоила очень дорого и была скорее
престижным, чем повседневным продуктом питания. Разводили форель
фактически кустарным способом и получение порционной навески
(125-150 г) растягивалось на 3-4 года.
Становление промышленного форелеводства в Ропше относится к
началу 30-х годов, когда здесь открылся Всероссийский форелевый
питомник. В это десятилетие было сформировано маточное стадо,
заложены основы форелеводства в стране. К сожалению, в годы Второй
мировой войны пруды были разрушены, стадо утрачено, и после ее
окончания пришлось начинать все практически с нуля.
В 1948 г. из Германии из хозяйства в Ропшу привезли 80 тыс. шт.
икры радужной форели, которую проинкубировали, а затем вырастили
9,5 тыс. сеголеток в прудах на естественном корме. Из этой рыбы
создали маточное стадо, которое послужило основой для развития
форелеводства страны: икра из Ропши поставлялась по всему
Советскому Союзу. В результате длительной селекционной работы с
этим стадом была создана одна из двух принадлежащих ФСГЦР
официально зарегистрированных пород форели – Рофор (сокращение от
Ропшинская форель).
Другая порода создавалась с середины 70-х годов ХХ века на основе
проходной формы форели – стальноголового лосося. В ходе
селекционной работы широко использовались методы семейной
селекции с оценкой производителей по качеству потомства и
постановкой близкородственных скрещиваний в ряду поколений. В
14
структуру породы входят аутбредная и инбредная составляющие. Она
носит имя Росталь (сокращение от Ропшинский стальноголовый).
Выведение пород осуществлялось на фоне постепенно меняющейся
биотехники выращивания. Первоначально весь цикл (кроме нереста)
проходил в прудах на естественной кормовой базе, затем появились
земляные форелевые канавы и садки, установленные в прудах. Здесь
уже начал применяться искусственный корм, сначала пастообразный, на
основе селезенки, а затем гранулированный. Однако основной для
рыбоводства фактор, температура воды, менялся мало: так как
местность богата подземными источниками, то летние температуры не
поднимались выше 15, а среднегодовая температура составляла около
7.С.
С началом нового века в России начался быстрый рост производства
товарной форели, а одним из факторов, сдерживающих этой процесс,
был дефицит посадочного материала. Технические возможности
ФСГЦР в этот период позволяли производить к середине мая (времени
максимального спроса на посадочный материал) не более 1,5 млн. шт.
молоди средним весом 1 г. При этом себестоимость молоди была очень
велика из-за затрат на водоподготовку (подогрев, дегазация,
оксигенация). В данной ситуации товарные фермы предпочитали
закупать более крупный посадочный материал в Финляндии. Перед
ФСГЦР со всей очевидностью встал вопрос о необходимости коренного
изменения технологии разведения рыбы.
С самого начала было очевидно, что реконструкция должна быть
основана на замкнутом водопотреблении. Во-первых, температура
ключевой воды на протяжении года колеблется около 6.С и для
интенсивного выращивания молоди ее необходимо подогревать. Во-
вторых, дебет ключей неуклонно снижается и воду необходимо
использовать рационально. После изучения разных систем УЗВ был
выбран тип с горизонтальной циркуляцией воды, широко используемый
в Дании. Одним из существенных доводов в пользу такой системы
явилась ее надежность и простота устройства, что немаловажно для
России.
В 2008 г. Министерством сельского хозяйства Российской Федерации
было выделено финансирование, и нами начаты работы по
реконструкции цеха подращивания молоди.
15
В первую очередь в цеху был освобожден небольшой участок для
строительства модуля по выращиванию малька с момента перехода на
активное питание и до средней массы 1 г.
Этот блок изготовлен из листового полипропилена и включает в себя
12 бассейнов длиной 9 м и шириной 1 м. Глубина воды – 80 см. Расход
воды, обеспечиваемый эрлифтом, составляет 150 л/с, причем подпитка -
всего 1-2 л/с. Вода, выходящая из бассейнов, проходит над сборником
фекалий, где оседают тяжелые фракции загрязнений. Ежесуточно они
удаляются с помощью фекального насоса. Затем вода поступает в блок
биологической очистки, включающий фильтр псевдоожиженного слоя,
керамзитовый фильтр и низконапорные аэраторы, а затем эрлифтом
снова подается в бассейны. Кормление мальков осуществляется
кормами фирмы «Биомар» ленточными кормораздатчиками с 24-
часовым механизмом.
В каждый бассейн модуля высаживается по 100 тыс. шт. мальков
средней массой 300 мг. Выращивание до 1 г осуществляется, как
правило, при 16-17oС и занимает около двух недель. Еженедельно в
модуль высаживается 300-500 тыс. рыб и столько же (за вычетом
отхода) переводится на дальнейшее выращивание в вырастной модуль.
Таким образом, в рабочем режиме в модуле находится более 1 млн.
мальков, а ихтиомасса доходит до 1 т. Подчеркнем, что в модуле
площадью немногим более 200 м2 за один цикл выращивается столько
рыбы, сколько до реконструкции производил весь цех.
На следующем этапе реконструкции в цеху были построены
вырастной модуль и модуль для содержания ремонтно-маточного стада.
Вырастной модуль изготовлен из бетона и включает 14 бассейнов
размером 2 х 10 м и глубиной 1 м. Устройство этого модуля идентично
мальковому, а единственное отличие заключается в том, что фекальные
ловушки не чистятся насосом, а осадок сбрасываются в коллектор
самотеком. Эрлифт обеспечивает циркуляцию 700 литров воды в
секунду, подпитка не превышает 4 л/с. Кормление осуществляется
кормораздатчиками T-Dram 2000 с пневматическим разбрасывателем.
Как уже отмечалось, в каждый бассейн высаживается по 90-100 тыс.
шт. 1-граммовой молоди. В зависимости от складывающейся ситуации,
выращивание в этом модуле осуществляется до 5-10 г. Максимальная
нагрузка на бассейн может достигать 1 т, а на модуль в целом – 10 т.
16
Зимой 5-граммовая молодь через адаптационные бассейны
высаживается в зимовальный модуль, располагающийся на улице перед
зданием цеха. Весной, молодь последних туров нереста, отпускается
покупателям непосредственно из цеха. Все пересадки осуществляются с
использованием рыбонасоса. После реализации посадочного материала
товарным хозяйствам, модуль используется для выращивания
племенной молоди и посадочного материала для реализации
сеголетком/годовиком.
При средней массе племенной молоди 30-50 г осуществляется
машинная сортировка рыбы на четыре размерные группы. Для
дальнейшего выращивания оставляется 20-30% крупной рыбы, за
исключением рекордистов, которая пересаживается в модуль для
содержания ремонтно-маточного стада. Этот модуль по устройству и
параметрам практически идентичен вырастному, но включает на два
бассейна меньше, а глубина их на 20 см больше. Эрлифты обоих
модулей работают от одной воздуходувки с мощностью двигателя
30 кВт и избыточным давлением 400 мБар.
Модуль, расположенный на открытой площадке, используется для
накапливания молоди перед реализацией, выращивания сеголеток и
годовиков.
Таким образом, технология разведения рыбы на участке выглядит
следующим образом. Ключевая вода температурой 6оС, в количестве
10-12 л/с, подается в автономную газовую котельную, где нагревается
до 16-18оС. Нагретая вода подается в два бака емкостью 6 м3 каждый,
установленные над инкубатором. Для удаления избыточных газов в
баках организована продувка воздухом. При необходимости теплая вода
в баках может смешиваться с холодной. За один цикл в инкубаторе
подращивается до 700 тыс. личинок. Вода, использованная в
инкубаторе, собирается и подается в мальковый, вырастной и маточный
модули. В свою очередь около 8-10 л/с воды, использованной в этих
установках, сбрасывается в уличный модуль. За счет поступления
довольно большого количества теплой воды, температура в уличном
модуле зимой колеблется около 7оС, не опускаясь ниже 5оС даже в
сильные морозы. Грязная вода, сбрасываемая из фекальных ловушек
всех модулей и при чистке керамзита, собирается в пруде-отстойнике. В
период максимальной нагрузки (в апреле и мае до начала реализации
17
посадочного материала) на 12 л/с выращивается одновременно до
миллиона личинок, 30 т молоди средней массой от 300 мг до 50 г и 40 т
годовиков средней массой 200-300 г.
В результате внедрения новой технологии впервые в истории
ропшинских пород форели произошло существенное изменение
температуры выращивания рыбы: на протяжении всего жизненного
цикла она стала близка к оптимальной. В период нереста и инкубации
икры температура составляет от 10 до 12°С, а при выращивании
молоди, как правило, 16-17°С. Столь радикальное изменение условий
обитания поставило перед специалистами и новую селекционную
задачу: добиться повышения выживаемости и темпа роста молоди при
ее интенсивном выращивании.
Выбор основателей новой породы осуществляли среди 5-годовалых
самок двух лучших семей породы Росталь в феврале-марте 2010 года.
Средняя масса тела самок колебалась от 1,6 кг до 3,5 кг (в среднем –
2,3 кг), рабочая плодовитость – от 3,7 до 9,0 тыс. шт. икринок (в
среднем – 5,5 тыс. шт.), масса икринки – от 40 до 80 мг (в среднем –
56 мг). Самки, чье потомство было выбрано для дальнейшего
разведения, мало отличались по массе тела от средних для семьи
значений и сильно различались между собой по рабочей плодовитости,
что видно из данных, приведенных ниже:

самки
Масса тела, кг Плодовитость,
шт.
Масса икринки,
мг
1 2,0 4450 57,5
2 2,3 6360 58,8
3 2,5 9080 64,1
Выбор именно этих самок был связан, в первую очередь, со стабильно
высокими показателями жизнеспособности их потомства.
Самцов для постановки парных скрещиваний выбирали среди 4-
годовалых рыб аутбредной составляющей породы. Для скрещиваний
использовали рыб с массой тела немного выше среднего значения,
максимальным объемом (от 11 до 30 мл) и высоким качеством спермы.
Всего было поставлено 14 парных скрещиваний. Семьи оценивали по
выживаемости и темпу роста на разных этапах онтогенеза.
Инкубацию икры осуществляли при 10°С, выдерживание – при 11°С.
После перехода личинок на экзогенное питание температура была
18
поднята до 18°С. При достижении средней массы 1 г (01.06.2010 г.) пять
выбранных к этому моменту семей были высажены в мальковый
модуль.
Летнее выращивание проходило при температуре 13-15°С (котельная
летом отключается) и к 1 октября средняя масса сеголеток по семьям
колебалась довольно значительно, что видно из данных, приведенных
ниже:
№ семьи Количество, шт. Средняя масса, г
8 1180 131
9 1100 166
12 1270 174
13 1240 113
14 2460 113
Общая нагрузка на мальковый модуль все лето поддерживалась на
уровне 2 т (на свободных площадях выращивали племенную молодь от
массовых скрещиваний). До созревания было доведено три семьи
полных сибсов.
В годовалом возрасте созрели самцы, часть их была отбракована и
сдана в товар, а три лучшие семьи, характеристика которых приведена
ниже (на 22.02.2011 г.), были пересажены в маточный модуль:
№ семьи Количество, шт. Средняя масса, г
8 1050 670
12 720 960
14 1520 700
Осенью того же года, в возрасте 18 месяцев, созрели самки семьи №14
(самка-основатель №3). Их средняя масса превышала 1 кг, рабочая
плодовитость составляла 4200 икринок, а относительная - 2100 шт./кг,
масса икринки – 47,4 мг. Отметим, что по массе тела такие показатели
были характерны для 3-годовалых, а по плодовитости – для 4-годовалых
самок, выращенных по старой технологии.
Самки двух других семей в этом возрасте не созрели. Представляет
интерес то, что самки, давшие потомство созревшее и не созревшее в
двухлетнем возрасте (семьи №8 и 14), являются полными сибсами, и
межсемейное различие по этому признаку предопределили, по-
видимому, не родственные самцы.
19
Учитывая, что товарные хозяйства нуждаются в посадочном
материале с разным возрастом созревания самок (в зависимости от того,
производят они только мясо или также и икру), для дальнейшей оценки
были оставлены все три описанные выше семьи.
Следующие двенадцать месяцев выращивание проходило в маточном
модуле. После предварительной оценки в начале нерестового сезона
семья №8 была исключена из дальнейшего разведения. Характеристика
3-годовалых самок семьи №12 (впервые созревших) и семьи №14
(повторно созревших) приведены в таблицах I и II.
Таблица I. Характеристика 3-годовалых самок семьи № 12
Признак lim Хср.±mx V,%
Масса тела, г 2370 - 5200 4080 ± 114,5 18,2
Длина тела, см 50,5 – 69,0 62,6 ± 0,64 6,7
Рабочая плодовитость,
шт.
2891 - 10712 7824 ± 277,6 23,0
Относительная
плодовитость, шт/кг
794 - 2616 1929 ± 54,4 18,3
Масса икринки, мг 46,3 – 80,6 62,1 ± 1,07 11,2
Таблица II. Характеристика 3-годовалых самок семьи № 14
Признак lim Хср.±mx V,%
Масса тела, г 1920 - 4300 3098 ± 85,9 18,6
Длина тела, см 51,5 – 64,5 58,5 ± 0,47 5,3
Рабочая плодовитость,
шт.
3707 - 9397 5654 ± 199,8 23,7
Относительная
плодовитость, шт/кг
1191 - 2326 1833 ± 43,7 16,0
Масса икринки, мг 51,5 – 84,7 64,2 ± 0,94 9,8
Как видно из данных, приведенных в таблицах, масса тела самок
впервые созревшей семьи на 32%, а рабочая плодовитость – на 38%
выше, чем в повторно созревшей, что вполне закономерно. По
относительной плодовитости и массе икринки семьи не различались.
В пик нерестового сезона было поставлено 19 парных скрещиваний:
из них внутри семьи № 12 – 9 скрещиваний, внутри семьи №14 – 10
скрещиваний. Производителей выбирали по отработанной схеме:
сначала по массе тела (несколько выше средних значений), затем –
20
самок по рабочей плодовитости (с максимальными показателями) и
массе икринки (не ниже среднего значения); самцов – по объему порции
спермы и концентрации сперматозоидов (с максимальными
показателями).
Оценку семей, являющихся первым поколением, полученным от
близкородственного скрещивания, также осуществляли по уже
апробированной схеме: по выживаемости эмбрионов, личинок и
мальков, а также их тему роста. Практически все семьи показали
жизнеспособность выше нормативной (от 82 до 97% за этап), однако
семьи с более низкими показателями выживаемости и темпа роста
выбраковывались. При среднем весе рыб 2-3 г в выбранных семьях был
проведен массовый отбор по этому признаку напряженностью около
50%. Выращивание сеголеток проходило в мальковом модуле и их
характеристика по состоянию на 01.09.2013 г. приведена в таблице III.
Таблица III. Характеристика семей первого инбредного поколения
№ семьи-
продолжателя
№ семьи-
основателя
Количество,
шт.
Средняя масса
тела, г
3 12 3020 170
18 12 4170 120
22 12 1500 160
8 14 1730 140
9 14 2170 180
10 14 2510 190
Исследования, проведенные при создании породы Росталь, показали,
что тщательный выбор основателей породы по качеству потомства и
отбор на племя семей с лучшими признаками приспособленности
(фитнес-признакам), к которым в первую очередь относятся
выживаемость, темп роста и плодовитость, позволяют за несколько
поколений добиться существенного прогресса, закрепить его и избежать
негативных последствий инбридинга. Вместе с тем, желательно иметь
некий генетический резерв, который может быть востребован в
дальнейшем. Поэтому, наряду с описанной работой, проводимой
методами семейной селекции, осуществляется и воспроизводство обеих
пород (Рофор и Росталь) методами массового отбора, направленное на
21
повышение приспособленности к новым условиям разведения, но с
сохранением исходного генетического разнообразия.
Суть методики заключается в следующем. Перед началом нереста
проводится отбор производителей по массе тела: для племенных
скрещиваний выбирают рыб с весом тела несколько выше среднего (в
пределах полутора среднеквадратического отклонения). В пик нереста
осуществляется племенная закладка. При этом в скрещивании
используется не менее, чем по 30 самок и самцов с максимальной
рабочей плодовитостью (объемом спермы). На сеголетках проводится
отбор по массе тела умеренной напряженности (20-30%). С переходом
на новую технологию выращивания основу гетерогенного племенного
стада стали составлять двух- и трехгодовалые рыбы, тогда как ранее это
были четырех- и пятигодовалые особи.
Средняя масса тела впервые созревающих 2-годовалых самок обеих
пород, выращенных в УЗВ (таблицы IV и V), превышает 2 кг, рабочая
плодовитость Росталь – 4300 шт., Рофор – 3500 шт. Эти показатели
соответствуют стандарту породы, разработанному на 4-годовалых
повторно созревающих самках. Относительная плодовитость Росталь
превышает 2 тыс. икринок на 1 кг массы тела, а Рофор 1700 шт./кг, что
также является очень высокими показателями и соответствует
межпородным различиям. Единственный показатель, по которому эти
самки уступают стандартам породы, это масса икринки, однако
выживаемость эмбрионов за время инкубации превышает нормативные
80%.
Таблица IV. Характеристика 2-годовалых самок форели Росталь
Признак lim Хср.±mx V,%
Масса тела, г 1480 - 3030 2092 ± 79,4 17,8
Длина тела, см 47,0 – 54,5 50,5 ± 0,44 4,1
Рабочая
плодовитость, шт.
2353 - 6443 4334 ± 254,4 27,5
Относительная
плодовитость, шт/кг
1238 - 3134 2087 ± 115,7 26,0
Масса икринки, мг 37,3 – 52,1 43,0 ± 0,81 9,0
22
Таблица V. Характеристика 2-годовалых самок форели Рофор
Признак lim Хср.±mx V,%
Масса тела, г 1450 - 2630 2139 ± 78,5 14,2
Длина тела, см 46,0 – 55,0 51,3 ± 0,69 5,2
Рабочая
плодовитость, шт.
2004 - 5315 3594 ± 261,0 28,1
Относительная
плодовитость, шт/кг
930 - 2480 1702 ± 123,7 28,1
Масса икринки, мг 38,1 – 54,6 46,7 ± 1,10 9,1
Таким образом, комбинирование технических возможностей УЗВ и
целенаправленной селекционной работы, а также производство
однополого (самочьего) посадочного материала и межпородного кросса,
проявляющего эффект гетерозиса по жизнеспособности, позволяет
наладить крупномасштабное производства молоди радужной форели
высоких рыбоводных кондиций, что является обязательным условием
для победы в конкурентной борьбе за потребителя. Только
использование замкнутого цикла водопотребления позволяет с
наименьшими затратами производить посадочный материал,
пользующийся в товарном рыбоводстве максимальным спросом:
молоди средней массой 5-10 г и годовиков - 100-300 г в мае, а также
сеголеток массой в октябре 50-70 г.
23
Нитрит-индуцированная метгемоглобинемия пресноводных рыб
при выращивании в рециркуляционных системах
Худая Л.В., Худый А.И.
Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича,
Черновцы, Украина
Аннотация
Исследовано содержание метгемоглобина и функционирование системы его
восстановления в эритроцитах пресноводных рыб при условиях нитритной
интоксикации.
Показано, что при действии NaNO2 в диапазоне концентраций 7,25-217,5 ммоль/л
приоритетными в восстановлении метгемоглобина становятся неферментативные
механизмы при участии таких низкомолекулярных соединений, как восстановленный
глутатион и аскорбат.
Ключевые слова: нитриты, метгемоглобин, глутатион, аскорбиновая кислота.
Введение
Среди основных факторов качества воды в установках замкнутого
водоснабжения особого внимания и постоянного мониторинга требуют
азотные показатели. Как известно, азот в рыбоводных системах
представлен в форме аммиака (NH3), ионов аммония (NH4
+), нитритов
(NO2
-) и нитратов (NO3
-). Поступление соединений азота в водную
среду частично обусловлено жизнедеятельностью самих объектов
аквакультуры, ведь основным продуктом белкового метаболизма у рыб
является аммоний. Кроме того, интенсивное выращивание рыбы в УЗВ
происходит при использовании высокобелковых кормов, которые
являются дополнительными источниками азота в водной среде.
Эффективным средством контроля над содержанием
высокотоксичных для рыб аммония и нитритов является
отрегулированная работа биофильтров. Именно на биофильтрах
благодаря работе нитрифицирующих бактерий происходит
двухстадийный процесс нитрификации, при котором на первом этапе
при участии бактерий рода Nitrosomonas происходит конверсия
аммония в нитриты, которые в дальнейшем окисляются в нитраты
благодаря работе другой группы нитрифицирующих бактерий –
24
Nitrobacter. Поскольку первая стадия окисления аммония в нитрит
имеет значительно больший энергетический выход, чем химическая
реакция окисления нитрита в нитрат, микрофлора, осуществляющая
первую стадию нитрификации, раст.т намного быстрее. Таким образом,
возникает возможность накопления в среде нитритов, что особенно
часто возникает в первые 4-8 недель при стартовом запуске
биофильтров. Кроме того, разбалансировка процессов нитрификации с
последующей возможностью аммонийно-нитритной интоксикации рыб,
может происходить даже при незначительной нехватке кислорода,
особенно при повышенной плотности посадки в УЗВ (Masser, 1999).
Основным проявлением нитритной интоксикации является усиленное
формирование в эритроцитах метгемоглобина (MtHb). Гемоглобин,
превращаясь в метгемоглобин при переходе железа гема в форму Fe3+,
утрачивает свою основную кислород-транспортную функцию, что
обуславливает развитие гемической гипоксии (Raja and Sapkal, 2011).
Гемоглобин рыб малоустойчив к окислению, поэтому даже в
физиологических условиях уровень MtHb у них может варьировать в
широких пределах (Солдатов, 2002). Отсутствие при этом видимых
признаков интоксикации объясняется эффективным
функционированием многокомпонентной метгемоглобинредуктазной
системы. Нефермента-тивное восстановление метгемоглобина
происходит при участии глутатиона и аскорбиновой кислоты. Однако,
основным фактором, который контролирует уровень оксигенации-
дезоксигенации гемоглобина, является функционирование фермента
NADH-зависимой метгемоглобинредуктазы (NADH-Н-цитохром b5-
редуктаза, КФ 1.6.2.2.), который специфически переносит электроны от
NADH через цитохром b5 на метгемоглобин. Однако работа системы
восстановления метгемоглобина в гемоглобин может оказаться
заблокированной при высоких концентрациях нитритов.
Целью данного исследования было определение влияния нитритной
интоксикации на содержание метгемоглобина и функционирование
системы его восстановления в эритроцитах пресноводных рыб.
25
Материалы и методы исследования
Для моделирования нитритного влияния нами была использованы
изолированные эритроциты Carassius gibelio (Bloch), Cyprinus carpio L.,
Hypophthalmichthys molitrix (Valenciennes), Acipenser ruthenus L. Забор
крови производили со спинной аорты с использованием гепарина в
качестве антикоагулянта. Эритроциты отделяли от плазмы
центрифугированием при 500g и трижды промывали в растворе
Рингера. Выделенные эритроциты распределяли на 6 групп:
контрольную и 5 опытных, которые инкубировали в растворе Рингера
со следующими концентрациями NaNO2: 7,25 ммоль/л (І группа), 14,5
(ІІ), 72,5 (ІІІ), 145,0 (IV) 217,5 ммоль/л (V группа). Известно, что
полулетальная доза нитрит-ионов в воде для целого ряда пресноводных
рыб составляет 1,45 ммоль/л (Alexander et al., 2009; Svobodova et al.,
2000). Учитывая, что для рыб характерна десятикратная аккумуляция
нитрит-ионов в плазме крови (Kroupova et al., 2006), концентрации
NaNO2 в среде инкубации эритроцитов были соответственно увеличены.
Содержание метгемоглобина оценивали спектрофотометрически
ацетон-циангидриновым методом (Минсельхозпрод РФ, 1999).
Метгемоглобинредуктазную активность определяли по скорости
восстановления метгемоглобина в присутствии NADH. Содержание
восстановленной аскорбиновой кислоты определяли по разности между
содержанием всех форм аскорбата и суммы дегидроаскорбиновой и
дикетогулоновой кислот (Горячковский, 2005). Содержание
восстановленного глутатиона определяли в реакции с 5,5-дитио-бис-(2-
нитробензойной) кислотой (Рахманова и сотр., 2009). Содержание
общего белка определяли методом Лоури, гемоглобина –
гемоглобинцианидным методом (Минсельхозпрод РФ, 1999).
Результаты и обсуждение
Проведенные исследования показали, что инкубация эритроцитов в
среде с возрастающими концентрациями NaNO2 у всех изучаемых видов
рыб приводит к увеличению содержания метгемоглобина по сравнению
с контрольными значениями (Рисунок 1).
26
Рисунок 1. Содержание метгемоглобина в эритроцитах пресноводных рыб при
действии различных концентраций NaNO2
Примечание (здесь и далее): К – контрольная группа, І – 7,25 ммоль/л NaNO2, ІІ – 14,5
ммоль/л, III -72,5 ммоль/л, IV – 145,0 ммоль/л, V – 217,5 ммоль/л.
Отметим, что эритроциты всех исследованных видов рыб практически
одинаково реагируют на концентрации NaNO2, близкие к
полулетальным дозам (ІІ, ІІІ группы). Видовые различия
прослеживаются при использовании как меньших (І группа), так и
гораздо больших концентраций нитритов (IV, V группы). Наиболее
остро, как видно из рисунка, на повышение концентрации NaNO2
реагируют эритроциты белого толстолобика.
Наличие таксономически обусловленных различий в характере
накопления метгемоглобина показано в работах ряда авторов (Alexander
et al., 2009; Svobodova et al.; 2000 Saleh and McConkey, 2012). Можно
предположить, что в основе установленной нами видовой специфики в
накоплении метгемоглобина лежат функциональные особенности
метгемоглобинредуктазных систем эритроцитов, направленных на
восстановление метгемоглобина.
В физиологически нормальных условиях основным компонентом
метгемоглобинредуктазной системы эритроцитов у всех позвоночных
животных, в том числе и у рыб, является NADH-Н-цитохром b5-
редуктаза (NADH-метгемоглобинредуктаза), которая обеспечивает
трансформацию 70-90% MtHb назад в гемоглобин (Saleh and McConkey,
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
K I II III IV V
% C. gibelio
C. carpio
H. molitrix
A. ruthenus
27
2012; Проданчук и Балан, 2007). Однако, как было показано нами ранее,
во всех вариантах использованных нами токсических концентраций
нитритов метгемоглобинредуктазная активность оказывается
неизменной (эритроциты стерляди) или угнетенной (эритроциты карася)
на фоне возрастания процентного содержания метгемоглобина (Худа та
ін., 2012а; Худа та ін., 2012б). Взаимодействие нитритов с ионом
железа гема гемоглобина позволяет допустить возможность подобных
взаимодействий и с другими гем-содержащими протеинами, в частности
каталазой, цитохромом b5 в составеметгемоглобинредуктазы (Moraes еt
al., 2002).
Наиболее вероятно, что при высоких концентрациях нитритов
основную функцию редукции MtHb берут на себя низкомолекулярные
компоненты системы – восстановленный глутатион и аскорбиновая
кислота.
Известно, что процесс окисления гемоглобина нитритами сопряжен с
генерацией активных соединений и свободных радикалов -
супероксидного анион-радикала, NO, ONOO-, Н2O2 т.п. Весомый вклад
в формирование антиоксидантного потенциала эритроцитов
принадлежит глутатиону, редокс-система которого (GSH-GSSG) служит
буфером, защищающим от деструктивного действия активных форм
кислорода.
Легкое окисление сульфгидрильных групп восстановленного
глутатиона защищает SH-группы гемоглобина и ряда белков и
ферментов эритроцитов от свободнорадикального окисления. Таким
образом, возможность прямого восстановления метгемоглобина и
антиоксидантные свойства GSH предопределяют его заметную роль в
системе поддержания структуры и функций гемоглобина. Показано, что
для эритроцитов рыб характерна высокая концентрация GSH.
Отношение GSH / Hb у них значительно выше, чем у млекопитающих
(Солдатов, 2002). Содержание восстановленного глутатиона в
организме рыб может колебаться в широких пределах (достигая у
некоторых представителей значений до 10 ммоль/мг белка), что
обусловлено значительными приспособительными возможностями
эритроцитов гидробионтов вследствие их пребывания в изменяющихся
условиях водной среды.
28
Результаты проведенных исследований показали, что для всех
исследуемых нами видов уровень восстановленного глутатиона лежит в
указанных пределах. Так, в эритроцитах карася и толстолобика
содержание GSH достигает близких значений – около 0,3 ммоль/мг
белка, в то время как для стерляди данный показатель составляет 0,1
ммоль/мг белка, а для карпа – 0,85 ммоль/мг белка (Рисунок 2).
Рисунок 2. Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах пресноводных
рыб при действии различных концентраций NaNO2
Для карпа и карася четко прослеживается тенденция к снижению
уровня восстановленного глутатиона по сравнению с контролем в
эритроцитах первых четырех экспериментальных групп. Полученные
результаты указывают на его активное окисление и, соответственно,
роль в процессах антиоксидантной защиты и восстановлении
метгемоглобина в эритроцитах при действии нитритов. Следует
отметить, что содержание GSH в эритроцитах всех исследуемых видов
рыб при инкубации с максимальной из использованных концентраций
NaNO2 (217,5 ммоль/л) не отличается от контрольных значений.
Касательно толстолобика и стерляди нами отмечено пониженное
содержание GSH только в ІІІ и ІV экспериментальных группах.
Вероятно, высокие концентрации глутатиона в эритроцитах I и II групп
обеспечивают активную работу аскорбатной редокс-системы, поскольку
восстановление дегидроаскорбиновая кислоты в аскорбиновую
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
K I II III IV V
ммоль/мг белка
C. gibelio
C. carpio
H. molitrix
A. ruthenus
29
происходит достаточно быстро в присутствии сульфгидрильных
соединений, таких как глутатион, цистеин.
Для проверки этого предположения, а также оценки роли
аскорбиновой кислоты в эритроцитах при нитритных интоксикациях
нами было исследовано содержание восстановленного аскорбата при
вышеуказанных условиях.
Полученные результаты указывают на существенно меньшую
концентрацию аскорбиновой кислоты в эритроцитах стерляди по
сравнению с другими исследованными рыбами (Рисунок 3).
В отличие от человека, приматов, некоторых млекопитающих
(морская свинка), у которых отсутствуют два фермента - D-
глюкуронредуктаза и L -гулоно-.-лактоноксидаза, обеспечивающих
синтез аскорбиновой кислоты из глюкозы, аскорбиновая кислота в
организме карповых рыб синтезируется. Однако, относительно
активности гулонолактоноксидазы – последнего энзима пути
биосинтеза аскорбата у осетровых в литературных источниках
присутствуют спорные данные (Gy. Papp et al., 1995; Verlhac and
Gabaudan, 2010). Несмотря на показанную некоторыми авторами
активность данного фермента и, соответственно, возможность синтеза
аскорбата некоторыми осетровыми указывается на необходимость
дополнительного поступления витамина С из экзогенных источников.
Рисунок 3. Содержание восстановленного аскорбата в эритроцитах пресноводных рыб
при действии различных концентраций NaNO2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
K I II III IV V
мкмоль/мл
C. gibelio
C. carpio
H. molitrix
A. ruthenus
30
Исследования показали пониженное содержание восстановленного
аскорбата в эритроцитах стерляди при всех используемых
концентрациях, причем уменьшение показателя наблюдали уже при
действии наименьшей концентрации (примерно в 1,5 раза). Очевидно,
это связано с переходом восстановленной аскорбиновой кислоты в
форму дегидроаскорбиновой после соответствующего использования в
качестве восстановленного агента и антиоксиданта.
Отметим, что существенное уменьшение содержания аскорбиновой
кислоты характерно для всех исследуемых видов рыб при инкубации
эритроцитов с концентрациями нитритов, близкими к полулетальным.
Таким образом, помимо общеизвестной роли аскорбиновой кислоты как
мощного компонента антиоксидантной защиты эритроцитов
необходимо отметить ее участие в восстановлении метгемоглобина и
защите от токсического влияния нитритов. Следовательно, получение
достаточного количества аскорбата с питанием при выращивании рыб в
УЗВ является абсолютно необходимым.
Литература
Alexander, J., Benford, D., Cookburn, A., 2009. Nitrite as undesirable
substances in animal feed. The EFSA Journal, 1017:1–47.
Gy. Papp, Zs., Jeney, Zs., Jeney, G., 1995. Comparative studies on the
effect of vitamin C feeding of European catfish (Silurus glanis L) and
sturgeon hybrid (Acipenser ruthenus L..Acipenser baeri L.). J. Appl.
Ichtyol., 11: 372–374.
Kroupova,H., Machava, J., Piackova, V., 2006. Nitrite intoxication of
cоmmоn carp (Cyprinus carpio L.) at different water temperatures. Acta
Vet. Brno. 75: 561–569.
Moraes, G., Avilez, I.M., Altran, A.E., 2002. Biochemical effects of
environmental nitrite in matrinxa (Brycon cephalus). Aquatic Toxicology:
Mechanisms and Consequences. International Congress on the Biology of
Fish. Symposium Proceedings. Vancouver, p. 15-26.
Raja, I.A. Sapkal, H.P., 2011. Blood and electrolyte responses in Clarias
batrachus exposed to nitrogen pollution. Biosci. Biotech. Res. Comm, 4
(2): 219–222.
Saleh, M.C., McConkey, S., 2012. NADH-dependent cytochrome b5
reductase and NADPH methemoglobin reductase activity in the
erythrocytes of Oncorhynchus mykiss. Fish Physiol. Biochem., 38 (6):
1807–1813.
31
Svobodova, Z., Machova, J., Poleszczuk, G., 2000. Nitrite poisoning of fish
in aquaculture facilities with water-recirculating system. Acta Vet. Brno.,
74: 129–137.
Verlhac, V., Gabaudan, J., 2010. The effect of vitamin C on fish health.
Centre for research in animal nutrition, Saint-Louis Cedex, pp. 35.
Горячковский А. М., 2005. Клиническая биохимия в лабораторной
диагностике. – Одесса, « Экология», 616 с.
Минсельхозпрод РФ, 1999. Методические указания по проведению
гематологического обследования рыб. Минсельхозпрод РФ, №13-4-2-
/1487, 20 с.
Проданчук Г. Н., Балан Г. М., 2007. Токсические метгемоглобинемии:
механизмы формирования и пути оптимизации лечения. Соврем.
проблемы токсикологии. 1: 37–45.
Рахманова T.И., Матасова Л.В., Семенихина A.В., Сафонова O.A.,
Макеева A.В., Попова T.Н. (ред.), 2009. Методы оценки
оксидативного статуса. Воронежский гос. ун-т, 62 с.
Солдатов А. А., 2002. Особенности структуры, полиморфизм и
устойчивость к окислению гемоглобинов рыб. Журн. эвол. биох. и
физиол. 38 (4): 305–308.
Худа Л.В., Худий О.І., Хачман Я.Ю., 2012 (а). Нітрит-індуковане
накопичення метгемоглобіну в еритроцитах стерляді. Сучасні
проблеми теоретичної і практичної іхтіології. Матеріали V
Міжнародної іхтіологічної науково-практичної конференції,
присвяченої пам„яті І.Д. Шнаревича (Чернівці, 13-16 вересня 2012 р.).
Чернівці: Книги-ХХІ, с. 241-243.
Худа Л.В., Марченко М.М., Хачман Я.Ю., Худий О.І., 2012 (б).
Вплив нітритної інтоксикації на систему відновлення метгемоглобіну
в еритроцитах карася сріблястого. Біологічні системи. 4 (4): 393–396.