Первый опыт получения реверсантов по полу у радужной форели в условиях УЗВ в Беларуси


Слуквин А. М.1, Метальникова К. В.2, Костоусов В. Г.3, Конева О.
Ю.1, Ровба Е. А.1
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск,
Республика Беларусь,
2ФГУП «ВНИРО», Москва, Российская Федерация,
3РДУП «Институт рыбного хозяйства» Республиканского унитарного
предприятия «Научно-практический центр Национальной академии
наук Беларуси по животноводству», Минск, Республика Беларусь
Аннотация
Цель исследований – научное обоснование способов повышения биопродуктивности
у радужной форели путем изучения и модификации экспрессии генома.
Изучено влияние андрогена на рост, развитие и реверсию пола у малька и сеголеток
радужной форели в условиях УЗВ в рыбопитомнике «Богушевский» Витебской
области (Республика Беларусь). Установлено, что при дозе препарата 7 мг/кг корма с
экспозицией обработки рыб в течение 3-х месяцев у молоди форели происходят
изменения в гонадах, связанные с реверсией пола с частотами от 25 до 42,9% от числа
обследованных особей. Форель, выращиваемая в условиях УЗВ и обработанная
андрогенами, не отличалась от контрольных особей по морфометрическим
показателям. В опыте и контроле у молоди был диагностирован ихтиофтириоз и
отмечена гибель рыбы. В такой обстановке выживаемость молоди в опыте с
андрогеном была на 11,5% выше, чем в контроле. Установлено, что результаты
молекулярно-генетических исследований по Y-специфическому локусу OmyY1 у
молоди форели позволяют осуществлять эффективную прижизненную выбраковку
самцов на стадии сеголетка. Результаты гистологических и генетических
исследований по определению пола у молоди форели совпали на 100%. Получены
новые знания о росте, выживаемости, возможностях модификации экспрессии генома
и у молоди лососевых рыб с помощью андрогенов в условиях УЗВ.
Ключевые слова: УЗВ, молодь радужной форели, метилтестостерон, экспрессия
генома, реверсанты по полу у сеголетков форели.
Введение
В последние десятилетия наблюдается бурный рост в товарном и
пастбищном лососеводстве (Hisar et al., 2012). Товарное производство
преимущественно самок лососевых для икорного производства и
восстановление популяций редких и исчезающих видов за счет самок в
настоящее время можно поставить на промышленную основу,
54
используя методы криоконсервации спермы реверсантов с геномом
самок.
Представленные исследования направлены на выполнение
Государственной программы развития рыбохозяйственной деятельности
на 2011-2015 годы утвержденной Постановлением Совета Министров
Республики Беларусь от 7 октября 2010 г. №1453 в плане
осуществления мероприятий по импортозамещению, включающих
увеличение производства и потребления деликатесной рыбы и
продуктов ее переработки внутри страны (Совет Министров
Республики Беларусь, 2010).
Если до 2010 года в Республике Беларусь выращивалось только около
40 тонн форели, то по программе рыбохозяйственной деятельности на
2011-2015 гг. планируется построить 11 специализированных
форелевых хозяйств мощностью 1,5 тыс. тонн товарной форели в год, в
том числе и для производства пищевой красной икры. В целом
выполнение Государственной программы на 2011-2015 годы позволит
увеличить объем производства в республике ценных видов рыб, таких
как лососевые и осетровые до 2,5 тыс. тонн в год.
Материал и методика
Материал был собран на базе УЗВ рыбопитомника «Богушевский»
Витебской области.
Проектная мощность форелевого хозяйства с УЗВ 100 тонн рыбы.
Установка представляет собой рыбоводные бассейны из сборных
железобетонных блоков и монолитного железобетона, размещенные на
открытом воздухе (Иллюстрации 1а 1,б). Источником водоснабжения
является артезианская скважина с температурой воды +4оС и
водоподающий канал из донного слоя головного пруда. Дебит
артезианской скважины составляет 29 л/с. Система бетонных бассейнов
разделена на два блока: выростной (блок бассейнов по доращиванию
молоди форели), который состоит из 11 рыбоводных бассейнов
размером 11,5х2х1,2 м и 2 бассейна технологического резерва
(Иллюстрация 2) и нагульный блок для товарной рыбы. Полезный
объем выростных рыбоводных бассейнов - 304 м3, площадь бассейнов
253 м2. На выростном участке находятся 2 бассейна для размещения
фильтров псевдосжиженного слоя размером 1,5х1,5х14,8 м. Семь
55
бассейнов размером 2х8,4 м предназначены для размещения фильтров с
пластиковыми капсулами диаметром 7 мм и длиной 9 мм. В выростном
блоке имеются иловые конуса для удаления остатков корма и
жизнедеятельности молоди форели. Для дегазации и насыщения
кислородом воды предусмотрено устройство из трех низконапорных
аэраторов общей площадью 24 м2. Циркуляция технологической воды
обеспечивается за счет работы эрлифта-аэратора производительностью
700 л/сек. При увеличении температуры воды свыше +18оС
предусмотрено устройство для ввода кислорода в воду OXYPLUSE
017100. Доставка жидкого кислорода на объект производится
автотранспортом. Контроль и регулирование кислорода в воде
осуществляется автоматической системой OXYGuard-Commander.
Уровень рН в воде контролируется системой OXYGuard рН Manta.
Блок бассейнов для выращивания товарной рыбы (Иллюстрации 3а,
3б, 3в) состоит из 4-х рыбоводных бассейнов размером 31,4х3,5 м
полезным объемом 571 м3.
Иллюстрация 1а. УЗВ в рыбопитомнике Богушевский
Иллюстрация 1б. Эрлифт-аэратор в рыбопитомнике Богушевский
56
Иллюстрация 2. Выростной блок УЗВ
Иллюстрация 3а. Нагульный блок УЗВ
57
Иллюстрация 3б. Фильтры нагульного блока УЗВ
Иллюстрация 3в. Эрлифт-аэратор нагульного блока УЗВ
Площадь бассейнов 440 м2. В нагульном блоке имеются также 2
бассейна, предназначенные для размещения фильтра псевдосжиженного
слоя размером 1,5х1,5х11,5 м и 7 бассейнов размером 6х2 м для
размещения фильтров из пластиковых капсул. Общая площадь
фильтров 84 м2. На товарном блоке также предусмотрены иловые
58
конуса для сбора и утилизации остатков корма и жизнедеятельности
товарной форели. Имеется также три низконапорных аэратора общей
площадью 24 м2. Циркуляция воды обеспечивается эрлифт-аэратором. В
наличии 4 устройства для ввода кислорода в воду. Для контроля
гидрохимических параметров используется переносной термооксиметр
Polaris.
Цикл выращивания рыбы в УЗВ следующий: весной в выростном
блоке размещают 280 тыс. малька форели средней массой 5 г и
доращивают до ноября месяца средней массой сеголетка свыше 100 г. В
ноябре сеголетка форели вылавливают и перевозят на зимовку на садки
тепловодного канала Новолукомльской ГРЭС. После зимовки весной
следующего года рыбу средней массой 400 г возвращают в количестве
75 тыс. годовиков в УЗВ для товарного выращивания до средней массы
рыбы 1 кг.
Объектом исследований являлась молодь радужной форели
(Oncorhynchus mykiss W.). По достижении средней массы молоди 5
грамм, всю экспериментальную и контрольную партию рыб завезли в
рыбопитомник «Богушевский» Витебской области для дальнейшего
доращивания.
В рыбопитомнике «Богушевский» под дальнейшее выращивание
молоди было задействовано только 2 бетонных бассейна (1 опытный и
1 контрольный).
В опытный бассейн №6 было высажено 10,1 тыс. экз. молоди, в
контрольный бассейн №7, соответственно - 10,0 тыс. экз. молоди
средней массой 5,0 г.
Для кормления молоди использовали форелевые корма AllerAqua
(производства Польша), Raisio (производства Финляндия) и опытный
ростовой корм, рецептуры РУП «Институт рыбного хозяйства», в
которые добавляли, растворенный в этиловом спирте метилтестостерон
в концентрации 7 мг/кг корма. Длительность кормления молоди
кормами с добавкой андрогена составляла 3 месяца (с 20 апреля по
19 июля).
Норма кормления устанавливалась каждые три дня для каждого
отдельного лотка, при этом для расчетов нормы кормления включали
запланированные увеличения массы. Во время и в конце эксперимента
59
были определены следующие показатели: эффективность кормления,
выживаемость, ростовые характеристики.
В процессе работ вели наблюдения за качеством среды обитания и
соответствием условий выращивания нормативным показателям,
показателями темпа линейного и весового роста, биохимическим
составом тканей экспериментальной и контрольной групп, включая
«красную» и «белую» кровь. На основе прижизненных измерений и
исследований фиксированного материала определяли степень
морфометрических различий молоди получавшей гормональный
препарат и без него.
Изучение гидрохимических показателей в лотках и бассейнах
выростного модуля форелевого комплекса проводили по стандартным
методикам гидрохимических исследований (ГКНТ СМ СССР, 1978).
Содержание растворенного кислорода, величину рН и температуру
определяли приборами оперативного контроля «Horiba-U-7» и «Hanna».
Показатели темп роста и морфометрические характеристики
рассчитывали с использованием методик ихтиологических
исследований, изложенных в пособии И.Ф.Правдина (Правдин, 1966).
Биохимические и гематологические исследования проводили по
стандартным методикам (Лиманский и сотр., 1984).
Всего было отобрано и обработано 20 проб воды на полный анализ,
525 экз. молоди форели на анализ рыбоводно-биологических
показателей и биохимических показателей.
Для проведения гистологических исследований молодь форели
фиксировалась в растворе Чемберлена или Буэна прижизненно, после
резекции брюшины у каждой форели. Фиксация проводилась по всем
правилам (Роскин и Левинсон, 1957; Паушева, 1988). Перефиксацию
проб проводили в 70о ректифицированном этиловом спирте в
биопсийные кассеты, каждая проба в отдельную кассету и каждая
кассета помещалась в стеклянный сосуд с прит.ртой пробкой на 48
часов, заполненный 70о этиловым спиртом. Автомат для
гистологической обработки представлен на иллюстрации 4.
60
Иллюстрация 4. Автомат для гистологической обработки тканей карусельного типа
модель STP-120
Проводку проб в биопсийных кассетах осуществляли через автомат
для гистологической обработки тканей карусельного типа (Модель STP
-120), (Иллюстрация 4); заливку в парафин - через заливочную станцию
ЕС 350 (Иллюстрация 5).
Иллюстрация 5. Заливочная станция EC-350
Продольные срезы толщиной 6 мкм делали на санном микротоме
«MICROMHM 440 E» (Иллюстрация 6). Полученные срезы окрашивали
гематоксилином Джилла 2 [BIOVITRUM, 2012] с докраской эозином.
61
Иллюстрация 6. Санный микротом «MICROMHM 440E» и термальный столик
Фотографии готовых гистологических препаратов сделаны с помощью
микроскопа Leica, совмещенного с компьютерной системой, с
автоматической фотокамерой Leica DC при увеличении окуляра 10х и
объективов х10, 20, 40, 100 (Иллюстрация 7). Для изготовления
цифровых микрофотографий гистологических препаратов использовали
программу DC Viewer, соединенную с программой редактирования
изображений PhotoShop 4.0. Всего обработано 59 проб молоди
радужной форели из р/п «Богушевский.
Иллюстрация 7. Микроскоп с компьютерной системой Leica DC
Материалом для проведения молекулярно-генетических исследований
являлись законсервированные в 96 %-ном этаноле фрагменты
хвостового плавника молоди форели. В задачи исследования входило
62
прижизненное определение самцов радужной форели на ранних стадиях
онтогенеза у мальков и сеголеток с использованием AFLP праймеров.
Впервые Y-специфическая последовательность ДНК у радужной
форели была найдена J.P. Brunelli и его коллегами (Brunelli et al., 2008,
2010). Изначально специфический для особей мужского пола фрагмент
ДНК был выявлен с помощью AFLP-технологии у чавычи. Данный
фрагмент был извлеч.н из геля, повторно амплифицирован с
использованием соответствующей селективной комбинации AFLP-
праймеров. Амплифицированные фрагменты были отсеквенированы
непосредственно и клонированы посредством лигирования фрагментов
в вектор pGEM-T. Клонированные вставки были затем
отсеквенированы, и к ним были подобраны праймеры.
Для выявления Y-специфической последовательности ДНК у
радужной форели на первом этапе была использована комбинация
праймеров к Y-хромосоме чавычи к участку OtY2. В результате был
получен ПЦР-продукт длиной 995 пар оснований, который был затем
отсеквенирован. Гомология данного участка ДНК радужной форели с
соответствующим участком ДНК чавычи составила 96 %. Геномные
библиотеки радужной форели были просмотрены на клоны,
содержащие этот продукт, которые затем были изолированы и
отсеквенированы. Это позволило распознать и охарактеризовать 21 kb
последовательности ДНК Y-хромосомы радужной форели, которая
выявила высокое сходство с последовательностью Y-хромосомы
чавычи, расположенной возле OtY3-участка. Гомологичная
последовательность начинается в OtY2 пол-специфическом месте
соединения, образованном инсерцией non-LTR ретротранспозона/ non-
LTR ретровируса «сходного с ReO_6» у чавычи, кижуча, кеты и нерки.
Этот ретротранспозонный элемент отсутствует у OtY2-гомолога
радужной форели, который обозначен авторами как OmyY1 (Brunelli et
al., 2010).
Амплификация OmyY1-участка радужной форели с помощью
предложенных в статье Brunelli et al. (2008) праймеров да.т ПЦР-
продукт длиной 792 пар оснований. Точность идентификации пола
посредством данного молекулярно-генетического маркера составляет
порядка 96,5% согласно данным, привед.нным в статьях Brunelli et al.
(2008, 2010).
63
Таким образом, мы предприняли попытку оценить точность
идентификации самцов среди молоди форели, участвующей в нашем
эксперименте, посредством молекулярно-генетического подхода. Для
этого мы провели генотипирование отобранных образцов радужной
форели по локусу OmyY1. Полученные данные сравнили с
результатами параллельно провед.нных гистологических исследований,
выполненных сотрудниками ВНИРО (г. Москва).
ДНК выделяли из плавников рыб методом фенол-хлороформной
экстракции. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК определяли
спектрофотометрически на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro
UV/Visible (Biochrom Ltd.) (Иллюстрация 8). Спектрофотометрический
анализ степени загрязнения полученных препаратов ДНК белками,
провед.нный на основе соотношения коэффициентов поглощения
А260/А280 (норма в диапазоне 1,8-2,0) подтвердил удовлетворительную
степень очистки полученных препаратов ДНК. Среднее соотношение
коэффициентов поглощения А260/А280 в июньской выборке составляло
1,88±0,03, в августовской выборке – 1,54±0,0,05. Концентрация ДНК в
препаратах, выделенных из плавников рыб, в среднем составляла в
июньской выборке 1483,47±151,18 мкг/мл, в августовской выборке –
1004,72±174,69.
Иллюстрация 8. Спектрофотометр Ultrospec 3300 proUV/Visible (BiochromLtd.)
Качество выделенной ДНК проверяли электрофоретически в 2%
агарозном геле (Agarose D1 Low EEO, Conda) (Иллюстрация 9).
64
Иллюстрация 9.Гель с выделенной ДНК
радужной форели. М – маркер молекулярного веса
GeneRullerTM 100bpPlusDNALadder (Fermentas)
Полученные результаты (Иллюстрация 9) указывают на
удовлетворительное качество выделенной ДНК (наличие
высокомолекулярной ДНК).
Амплификация. Для оценки гетерогенности генотипов исследуемых
особей радужной форели по локусу OmyY1 использовали ПЦР с
комбинацией праймеров, предложеной в статье Brunelli et al. (2008).
ПЦР-смесь (20 мкл) содержала 2,0 мкл 10х ПЦР-буфера (10x
DreamTaq buffer, Fermentas), содержащего 20 мМ MgCl2; 2,0 мкл 10х
d.NTP-mix (Праймтех, Беларусь); .10 пмоль праймера (Праймтех,
Беларусь); 0,05 ед./мкл DreamTaq ДНК полимеразы (Fermentas); 1 мкл
ДНК-матрицы и Milli-Q воду до общего объ.ма 20 мкл.
Амплификацию проводили на амплификаторе C1000TM ThermalCycler
(Bio-Rad, США) (Иллюстрация 10) при следующих условиях
(Иллюстрация 11).
Иллюстрация 10. Амплификатор MyCyclerTM (Bio-Rad, США)
65
Иллюстрация 11. Протокол проведения ПЦР
Электрофорез. Продукты амплификации подвергали
электорофоретическому разделению в 2% агарозном геле (AgaroseD1
LowEEO, Conda)с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в 1х
ТBЕ-буфере в устройстве для горизонтального электрофореза CompactL
(Biometra, Германия).
Визуализацию геля осуществляли с помощью системы гель-
документирования GelDocXR (Bio-Rad, США) (Иллюстрация 12).
Иллюстрация 12. Система GelDoc 2000 (Bio-Rad, США)
Полученные изображения обрабатывали с помощью программы
QuantityOne 4.4 (Bio-Rad, США).
Методики учета рыбоводных показателей. При анализе результатов
выполнения экспериментальных работ с андрогенами учитывали
66
рыбоводные показатели, предусмотренные нормативно-
технологической документацией в рыбоводстве: количество
посаженных личинок (малька) в тыс. шт.; средняя масса молоди при
посадке и вылове в (г); общая биомасса рыб в (кг); % выживаемости
молоди, % морфологических аномалий у молоди.
Статистическая обработка материалов произведена с использованием
программы «STATISTICA 6.0».
Результаты исследований
Схема получения в потомстве реверсантов преимущественно самок
широко известна: на первом этапе из небольшого количества обычной
молоди получают реверсантов с геномом самок, используя аналоги
тестостерона. На втором этапе этих реверсантов скрещивают с
обычными самками и в потомстве получают, преимущественно, самок
(Метальникова и сотр., 1989). Количество реверсантов можно
ограничить, используя их высокую жизнестойкость, и высокую
жизнестойкость их потомства - преимущественно самок (XXxXX>XX)
(Метальникова и Привезенцев, 2010).
Результаты исследований получены в 2012 г. при проведении
совместных работ с РУП «Институт рыбного хозяйства» РУП «Научно-
практический центр национальной академии наук Беларуси по
животноводству» (г. Минск). Гистологические исследования
выполнены в Федеральном государственном унитарном предприятии
«Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства
и океанографии» (г. Москва).
Гидрохимические параметры при выращивании молоди в условиях
УЗВ.
Установлено, что температура воды, в апреле-сентябре месяце
достигавшая в среднем 10-14.С, в октябре снизилась до 10.С, рН воды
находилось в пределах 8,2-8,3, содержание растворенного в воде
кислорода находилось в границах допустимых значений 6,5-10 мг/л.
Такие показатели как жесткость воды, кальций, магний и железо были
относительно стабильными и не подвергались большим колебаниям.
Что касается лимитирующих показателей, то в воде отмечено
повышение содержания минерального азота и перманганатной
67
окисляемости. Поскольку используется система замкнутого
водоснабжения, вероятнее всего биофильтры не справлялись с
возрастающей биогенной нагрузкой и не обеспечивали в полной мере
качественную очистку воды. В октябре такие формы минерального
азота в воде как нитритный и нитратный превышали границы
оптимальных значений в 4,8 и 2 раза соответственно (Таблица I). К
ноябрю в воде уменьшилось содержание нитритного и нитратного азота
на 65-68% соответственно, окисляемость на 15%, содержание фосфора
на 75% по сравнению с сентябрем, что связано со снижением
температуры воды и более медленным протеканием процессов
минерализации на фоне нормирования кормления рыбы.
Таким образом, по всем лимитируемым показателям за исключением
содержания минеральных форм азота, условия выращивания рыбы в
бассейнах комплекса были удовлетворительные.
Таблица I. Гидрохимические показатели воды в бассейнах форелевого комплекса
рыбопитомника «Богушевский»
Наименование
показателя
Единица
измерения
Содержание
по СТБ 1943-
2009
Бассейн №6 Бассейн №7
Температура .С не более . 20 10.7 10.7
Водородный
показатель
рН 7.0-8.0 8.3 8.3
Кислород
растворенный
мг/л 9.0 6.89 7.12
Аммоний-ион мгN/л 0.5 0.58 0.56
Нитрит-ион мгN/л 0.02 0.048 0.009
Нитрат-ион мгN/л 1.0 2.18 2.11
Фосфат-ион мгР/л 0.3 0.004 0.024
Железо общее мг/л 0.5 0.02 0.018
Окисляемость
перманганатная
мгО/л
10.0 11.30 12.44
Результаты морфометрических исследований у молоди радужной
форели под воздействием андрогена. Исследования проводили по
прижизненным измерениям и по фиксированному материалу. Ростовые
характеристики рыб зависели от гидрохимического режима и
кормления, поэтому в период нагула вели контроль за гидрохимическим
режимом выращивания рыб.
Примеры весового и линейного роста опытной и контрольной групп
форели представлены в таблицах II и III.
68
По данным таблицы III, средняя масса мальков радужной форели из
контрольного и экспериментального лотков и бассейнов в целом на
протяжении периода кормления метилтестостероном не отличались.
Статистически значимые различия (p<0.05) в массе выявлены только на
начальных этапах кормления (27.04.12, 12.05.12) молоди радужной
форели. Далее наблюдаются приблизительно одинаковые темпы роста.
Более отчетливо это продемонстрировано на иллюстрации 13.
Таблица II. Показатели роста сеголетков форели в период летнего нагула
Динамика изменения массы молоди радужной форели (W)
1,9
3,6
8,5
9,6
12,8
14,1
21,0
31,8
1,7
2,7
5,2
7,3
10,4
14,2
13,7
20,6
39,0
27.04.2012
12.05.2012
22.05.2012
06.06.2012
14.06.2012
27.06.2012
05.07.2012
17.07.2012
02.08.2012
Дата
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
50,0
Масса, г
Опыт
Контроль
Среднее
± Стандартная ошибка
±0,95Д оверительный интервал
Иллюстрация 13. График изменения массы тела молоди радужной форели опытной
и контрольной групп
Дата Опытная группа Контрольная группа
длина, см масса, г n,
экз.
длина, см масса, г n,
колеба- экз.
ния
сред-
нее
колеба-
ния
сред-
нее
колеба-
ния
сред-
нее
колеба-
ния
сред-
нее
06.06 6.8-9.4 8.15 4.8-11.6 7.64 15 - - - - -
28.06 5.9-10.1 8.99 3.0-11.0 8.43 16 7.2-10.0 8.5 5.5-12.0 8.7 15
11.08 12.5-13.1 12.8 31.5-32.6 32.0 4 - - - - -
69
Таблица III. Сравнение морфометрических параметров молоди радужной форели
между опытной и контрольной группами в динамике
T-тест для независимых выборок
Дата морфометрических
промеров опытной и
контрольной групп
Среднее
значение
Уровень
значимости
различий p
Объём
выборки
Стандартное
отклонение, SD
Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль
Вес, г
27.04.12{Опыт} vs.
27.04.12{Контроль}
1,9 1,7 0,047 51 50 0,47 0,43
12.05.12{Опыт} vs.
12.05.12{Контроль}
3,6 2,7 0,000 50 50 1,15 1,11
22.05.12{Опыт} vs.
22.05.12{Контроль}
5,2 5,2 0,925 50 50 1,29 1,46
06.06.12{Опыт} vs.
06.06.12{Контроль}
8,5 7,3 0,102 25 25 2,28 2,96
14.06.12{Опыт} vs.
14.06.12{Контроль}
9,6 10,4 0,176 26 26 2,31 2,25
27.06.12{Опыт} vs.
27.06.12{Контроль}
12,8 14,2 0,089 25 25 2,90 3,11
05.07.12{Опыт} vs.
05.07.12{Контроль}
14,1 13,7 0,741 25 26 3,83 4,66
17.07.12{Опыт} vs.
17.07.12{Контроль}
21,0 20,6 0,875 25 25 9,28 10,55
02.08.12{Опыт} vs.
02.08.12{Контроль}
31,8 39,0 0,104 25 25 16,32 14,50
Длина тела (L), см
27.04.12{Опыт} vs.
27.04.12{Контроль}
5,5 5,4 0,299 51 50 0,47 0,46
12.05.12{Опыт} vs.
12.05.12{Контроль}
6,7 6,1 0,001 50 50 0,74 0,95
22.05.12{Опыт} vs.
22.05.12{Контроль}
7,7 7,7 0,652 50 50 0,68 0,74
06.06.12{Опыт} vs.
06.06.12{Контроль}
8,7 8,0 0,015 25 25 0,81 1,23
14.06.12{Опыт} vs.
14.06.12{Контроль}
9,4 9,7 0,082 26 26 0,73 0,72
27.06.12{Опыт} vs.
27.06.12{Контроль}
10,4 10,7 0,310 25 25 0,74 0,85
05.07.12{Опыт} vs.
05.07.12{Контроль}
10,4 10,4 0,812 25 26 1,05 1,27
17.07.12{Опыт} vs.
17.07.12{Контроль}
11,2 11,0 0,723 25 25 1,84 2,04
02.08.12{Опыт} vs.
02.08.12{Контроль}
13,2 14,4 0,054 25 25 2,45 1,69
Длина тела до конца основания хвостового плавника (l), см
27.04.12{Опыт} vs.
27.04.12{Контроль}
4,8 4,6 0,054 51 50 0,43 0,37
12.05.12{Опыт} vs.
12.05.12{Контроль}
5,7 5,2 0,001 50 50 0,63 0,85
22.05.12{Опыт} vs.
22.05.12{Контроль}
6,8 6,8 0,861 50 50 0,67 0,70
06.06.12{Опыт} vs.
06.06.12{Контроль}
7,7 7,0 0,011 25 25 0,75 1,13
14.06.12{Опыт} vs.
14.06.12{Контроль}
8,4 8,7 0,161 26 26 0,69 0,65
27.06.12{Опыт} vs.
27.06.12{Контроль}
9,2 9,5 0,236 25 25 0,81 0,80
05.07.12{Опыт} vs.
05.07.12{Контроль}
9,3 9,2 0,711 25 26 0,79 1,23
17.07.12{Опыт} vs.
17.07.12{Контроль}
9,8 9,6 0,635 25 25 1,57 1,68
02.08.12{Опыт} vs.
02.08.12{Контроль}
11,7 12,8 0,054 25 25 2,13 1,62
70
Данные графика изменения длины тела мальков (Иллюстрация 14)
демонстрируют, что средняя длина тела мальков радужной форели из
контрольного и экспериментального бассейнов в целом на протяжении
периода кормления метилтестостероном не отличалась. Статистически
значимые различия (p<0.05) в длине тела (Таблица III) выявлены также
только на начальных этапах кормления (12.05.12, 06.06.12) молоди
радужной форели. Далее наблюдаются приблизительно одинаковые
темпы роста.
Данные графика изменения длины тела мальков до конца основания
хвостового плавника (Иллюстрация 15) также свидетельствуют о том,
что средняя длина тела до конца основания хвостового стебля плавника
мальков радужной форели из контрольного и экспериментального
бассейнов в целом на протяжении периода кормления
метилтестостероном не отличалась. Статистически значимые различия
(p<0.05) в длине тела до основания конца хвостового плавника (Таблица
III) выявлены также только на начальных этапах кормления (12.05.12,
06.06.12) молоди радужной форели. Далее наблюдаются
приблизительно одинаковые темпы роста.
Динамика изменения длины тела молоди радужной форели ( L)
5,5
6,7
7,7
8,7
9,4
10,4 10,4
11,2
13,2
5,4
6,1
7,7
8,0
9,7
10,7
10,4
11,0
14,4
27.04.2012
12.05.2012
22.05.2012
06.06.2012
14.06.2012
27.06.2012
05.07.2012
17.07.2012
02.08.2012
Дата
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Длина, см
Опыт
Контроль
Среднее
± Стандартная ошибка
±0,95Д оверительный интервал
Иллюстрация 14. График изменения длины тела молоди радужной форели опытной и
контрольной групп
71
Таким образом, мы не выявили влияния метилтестостерона на
морфометрические параметры молоди радужной форели. Следует
отметить, что замедление роста молоди радужной форели и в
контрольном, и в экспериментальном бассейнах в период с 26.07.12 по
17.07.12 (см. графики) связано, вероятнее всего, с заболеванием молоди
радужной форели ихтиофтириозом, а также бактериальной инфекцией,
которое произошло в этот период.
Отмечен более низкий уровень морфологических аномалий (главным
образом редукции жаберной крышки) у особей опытной группы. Если в
начале эксперимента (27.05.12) уровень морфологических аномалий
был приблизительно на одинаковом уровне в опытной выборке и в
контроле (15,4% и 20,0 % соответственно), то по ходу эксперимента
разница существенно возросла, достигая в контроле 64% особей с
морфологическими аномалиями. При этом в опыте доля особей с
морфологическими отклонениями никогда не превышала 24 %.
Динам ик а изм енения длины тела до к онц а
основания хвостового стеб ля (l) м олоди радужной форели
4,8
5,7
7,7
8,4
9,2
9,3
9,8
11,7
4,6
5,2
6,8
7,0
8,7
9,5
9,2
9,6
12,8
27.04.2012
12.05.2012
22.05.2012
06.06.2012
14.06.2012
27.06.2012
05.07.2012
17.07.2012
02.08.2012
Дата
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
12,0
13,0
14,0
Длина до конца хвостового стебля ( l), см
Опыт
Контроль
Среднее
± Стандартная ошибка
±0,95Д оверительный интервал
Иллюстрация 15. График изменения длины тела до конца основания хвостового
стебля молоди радужной форели опытной и контрольной групп
72
Изменение темпа роста и формирование под действием гормональных
препаратов преимущественно самочьего типа морфогенеза, должно
находить отражение в изменении пропорций тела (пластических
признаках), прежде всего тех, которые отражают экстерьерные
показатели и могут служить вторичными половыми признаками.
Исследование таковых на сеголетках ранее не проводили, поэтому
представляет интерес возможность их выявления на ранних стадиях
онтогенеза. Результаты промеров и их статистической обработки по
двум сборам проб молоди представлены в таблице IV .
Анализ данных таблицы IV показал, что в опытной группе разброс
значений признаков, оцениваемых как вторичные половые выше, чем в
контрольной, как и пределы колебаний от средней. Однако, на стадии
сеголетка эти различия еще не носят четкого статистического различия
(t< 3), что вероятно связано с недостаточностью их проявления на
данной стадии онтогенеза. Исследования будут продолжены на
двухлетках, на стадиях близких к возрасту полового созревания.
Таблица IV. Некоторые пластические признаки молоди форели, в % длины тела
по Смиту
Признак Опытная группа Контрольная группа t
lim M +/-m lim M +/-m
Антедорсальное
расстояние
43,3-
47,5
45,31 0,28 42,9-
46,6
44,71 0,30 1,5
Антевентральное
расстояние
44,5-
54,4
50,98 0,66 47,0-
51,1
49,47 0,27 2,1
Антеанальное
расстояние
63,0-
70,9
67,59 0,52 63,4-
68,2
66,32 0,28 2,2
Постдорсальное
расстояние
32,0-
37,6
35,06 0,36 33,3-
37,5
35,41 0,36 0,7
Длина спинного
плавника
9,9-
13,9
12,38 0,27 11,0-
14,6
12,19 0,25 0,5
Длина анального
плавника
7,8-
12,8
9,58 0,33 8,0-
10,2
8,98 0,17 1,6
Длина головы 21,8-
32,2
24,13 0,59 20,6-
25,0
22,37 0,31 2,6
Высота тела 20,2-
25,3
23,55 0,36 20,0-
25,0
22,49 0,38 2,0
Примечание: lim- разброс значений; M – среднее арифметическое; +/-m – ошибка
средней; t- критерий (нормированное отклонение)
73
Результаты биохимических и гематологических исследований. Как
показали результаты биохимического анализа в теле опытной группы
рыб не отмечено значительной разницы в содержании сухого вещества
и влаги по сравнению с контролем. Содержание сырого протеина у
опытных рыб было больше на 5,8% чем в контроле (73,52% против
67,68% в контроле). Это связано скорое всего с тем, что в опытном
корме протеина было на 7% больше, чем в контроле. Сырого жира
накоплено в теле практически одинаковое количество 30,96% у опытной
рыбы и 31,57% у контрольной, хотя в опытном корме липидов было
меньше на 13% чем в контрольном корме. Сырой золы тоже в опытной
группе было больше на 0,7% чем в контрольной, но и в опытной корме
содержание минеральных элементов кальция и фосфора было больше
чем в контрольном корме.
О степени усвоения питательных веществ исследованных кормов
организмом форели можно судить на основании эффективности
использования питательных веществ на рост. Эти показатели выражают
отношение между потребляемым кормом и ответной реакцией на него
животного, что имеет большое значение при оценке питательной
ценности кормов.
Для оценки физиологического состояния сеголетков форели были
проведены также гематологические исследования.
В крови изучены следующие показатели: общий белок сыворотки
крови, количество гемоглобина, содержание эритроцитов, лейкоцитов и
лейкоцитарная формула.
Как показали гематологические исследования до кормления форели
опытным кормом у сеголетка отмечен очень низкий уровень общего
белка сыворотки крови. Этот показатель колебался в пределах от 2,29
до 4,20, при среднем значении 3,15. Как среднее, так и максимальное
значение были существенно ниже нормы, которая составляет 6,2 г%.
Количество гемоглобина было весьма нестабильным, колебалось в
широких пределах – от 62 до 91 г/л. Среднее количество было
несколько выше нормы (71,0 – 73,0) и составляло 76,7 г/л.
В норме СОЭ у рыб должно быть от 1 до 4 мм/ч, средний показатель
1,85 укладывается в эти пределы. Однако для этого показателя также
характерны довольно большой размах значений: минимальное и
максимальное значения составили 1,0 и 5,0 мм/ч соответственно.
74
Количество эритроцитов и лейкоцитов также укладывалось в пределы
нормы: при норме для эритроцитов 1,15±0,08 млн./мкл средняя
величина составила 1,095 млн./мкл; при норме 58,6±6,4 тыс./мкл для
лейкоцитов средняя величина составила 57,3 тыс./мкл.
Лейкоцитарная формула крови показала, что до начала кормления
опытным кормом наблюдалось увеличение количества нейтрофилов, а
именно молодых форм (палочкоядерных) за счет лимфоцитов. Это не
является благоприятным показателем и может указывать на наличие
инфекции в организме рыбы. Эозинофилы и базофилы у сеголетка
форели отсутствовали, что является нормой.
После 30 дней кормления общий белок сыворотки крови как в опыте
(6,03 г%), так и в контроле (5,80 г%) приблизился к норме (6,2 г%).
Количество гемоглобина возросло и было выше нормативного, причем
показатели у опытной группы заметно превышали показатели группы
контрольной (опыт – 110,7 г/л, контроль – 88,3 г/л). Это благоприятный
показатель. Повышение уровня гемоглобина вероятнее всего, вызвано
усиленным ростом и связанным с этим ускорением метаболизма, когда
приходится транспортировать в ткани большее количество кислорода.
Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) являющаяся еще одним
показателем физиологического здоровья рыб, как в опыте, так и в
контроле находилась в пределах нормы.
Содержание основных клеточных элементов в крови – эритроцитов и
лейкоцитов также находилось в пределах нормы. Эритроциты довольно
крупные (характерно для молодых рыб, с возрастом они, как правило,
становятся мельче); этим можно объяснить тот факт, что гемоглобин –
выше нормы, а количество эритроцитов е. не превышает.
Лейкоцитарная формула в норме. Сдвига в сторону нейтрофилов за счет
лимфоцитов, характерного для формулы крови на предыдущем этапе
исследований, не наблюдается. Базофилы и эозинофилы отсутствуют,
как и должно быть у сеголетка радужной форели в норме.
Таким образом, исследования показали, что перед началом
эксперимента большинство показателей крови сеголетков форели
колебались в широких пределах. Однако средние показатели вполне
укладывались в пределы нормы, за исключением общего белка
сыворотки крови, который был почти в 2 раза ниже нормы, что
свидетельствовало о низком физиологическом статусе организма рыбы.
75
Нарушения наблюдались и в лейкоцитарной формуле: сдвиг формулы в
пользу палочкоядерных нейтрофилов за счет лимфоцитов, что могло
свидетельствовать о наличии инфекции в организме.
По окончании эксперимента лейкоцитарная формула
стабилизировалась и соответствовала норме, как в опыте, так и в
контроле. Показатели красной крови также были более стабильны и
укладывались в пределы нормы, даже общий белок сыворотки
достигнул практически до нормативного показателя. Количество
гемоглобина существенно выше нормы как в опыте (110,7 г/л), так и в
контроле (88,3 г/л), но это не является неблагоприятным показателем, а
есть следствие интенсивного роста и ускоренного метаболизма.
Таким образом, использование опытного корма (с гормоном) на
стадии сеголетка не оказало влияния на основные физиологические
функции тканей рыбы.
Результаты гистологических исследований у молоди радужной форели
под воздействием андрогена. В начале эксперимента были отобраны
пробы форели, использовавшейся для экспериментальной работы
массой 0,31 грамма в количестве 20 экз. В результате гистологического
анализа сагиттальных срезов молоди форели выявили следующие,
различающиеся по строению гонад группы молоди форели (Таблица V).
Таблица V. Количество мальков форели по строению гонад, по группам, %
Группы мальков форели Количество мальков
форели
1(самки) 25
2 (самцы) 40
3 (неопредел.нный пол) 35
Нами был сделан вывод, что наиболее перспективной для получения
реверсантов является группа форели с неопределенным полом. По
методике (Метальникова и сотр., 1989; Метальникова и Привезенцев,
2010) для получения реверсантов в большем количестве (до 100% от
количества, обрабатываемых гормоном генетических самок) форель
необходимо начинать обрабатывать гормоном до начала
цитологической дифференцировки гонад. Судя по результатам
гистологического анализа, проведенного на молоди, использованной
76
для экспериментальной обработки гормоном, была использована
молодь более старшего возраста, чем спустя три недели после выклева
личинок из икры, уже перешедшая на внешнее питание подросшая,
имеющая в гонадах цитологически определенный пол. Именно поэтому,
нами была названа наиболее перспективной третья группа форели с
неопредел.нным полом (Таблица V).
В период обработки и при окончании обработки метилтестостероном
экспериментальной форели динамика соотношения экспериментальной
форели с разными половыми характеристиками анатомического
строения гонад отражена в таблицах VI и VII.
Таблица VI. Соотношение экспериментальной форели с разным типом строения
гонад, в %, этапы II и III.
К концу обработки экспериментальной форели метилтестостероном
значительно увеличилось количество самок с резорбциями ооцитов
более 70% на срезах (Таблица VI). Количество интерсексов
уменьшилось в выборке, но увеличилось количество самцов (возможно,
за счет реверсантов) (Таблица VI).
На иллюстрациях 16 и 17 приведены фотографии характерных срезов
с гонад экспериментальных и контрольных рыб в августе 2012 г. при
окончании обработки экспериментальной форели метилтестостероном в
рыбопитомнике Богушевский.
На иллюстрации 16 сагиттальные срезы гонад интерсексов форели,
обработанной метилтестостероном. Особенно примечательна
фотография иллюстрации 16г, где видно образование в межовариальном
пространстве скоплений эпителиальных клеток, образующих нечто,
напоминающее железу внутренней секреции, что свидетельствует об
интенсивных процессах секретирования этими клетками (Иллюстрация
16г). Обилие мелких капилляров в толще гонад также свидетельствует
об активной секреторной деятельности, происходящей в гонаде.
Типы гонад, %
Этап Самки Самцы Интерсексы
Самка с
резорбциями
>70%
Самка
стериль-
ная
Самец
стериль-
ный
Стериль-
ные
II 7,1 14,4 42,9 7,1 7,1 7,1 14,3
III 0 33,3 25,0 33,3 8,33 0 0
77
Иллюстрация 16. Сагиттальные
срезы гонад интерсексов форели,
рыбопитомник «Богушевский».
Возраст форели 0+, обработана
метилтестостероном. Фиксация в
растворе Чемберлена, окраска в
гематоксилине Джилла 2 с
докраской в спиртовом 1% эозине.
Увеличение а) ок.10х, об. 40х; б)
ок. 10х, об. 20х; в, г) ок. 10х, об.
40х.
Пояснения к иллюстрации 16:
1. Митотические деления
гониальных клеток в скоплениях
2. Резорбирующиеся ооциты на 3-й
ступени фазы
протоплазматического роста
ооцитов.
3. Кровеносные капилляры
4.Митотические деления
гониальных клеток в капсуле
5. Железистое образование,
состоящее из железистых клеток
На иллюстрации 17 показан срез гонад самки и самцов,
зафиксированных в августе. Самка на 2-й стадии зрелости, а самцы
были на 2 и 4 стадиях зрелости
78
Иллюстрация 17. Сагиттальные срезы
гонад форели, р/п «Богушевский»
Витебской обл. Беларуси. Возраст
форели 0+, не обработана
метилтестостероном. Фиксация в
растворе Чемберлена, окраска в
гематоксилине Джилла 2 с докраской в
спиртовом 1% эозине. Увеличение а)
ок.10х, об. 40х; б) ок. 10х, об. 100х; в) ок.
10х, об. 40х, г) ок. 10х, об. 100х
Пояснения к иллюстрации 17:
1. Ооциты с резорбцией цитоплазмы на 3-й ступени фазы протоплазматического роста
ооцитов периода превителлогенеза.
2. Лизис цитоплазмы ооцитов на 3-й ступени фазы протоплазматического роста
ооцитов из-за нарушений в биотехнологии выращивания
3. Сперматозоиды в семенных ампулах
4. Сперматиды в семенных ампулах
5. Сперматоциты 1 и 2 порядков в семенных ампулах
6. Сперматоциты и образование сперматид
7. Эритроцит в толще гонады
79
В результате провед.нных исследований строения гонад у форели в
период экспериментальной обработки их метилтестостероном выявили
семь, различающихся по строению гонад, группы форели: самок,
самцов, интерсексов, стерильных интерсексов, стерильных самок,
стерильных самцов, стерильных форелей (Таблица VI). С точки зрения
перспективности работы в намеченном направлении наибольший
интерес представляют две группы форели: самки и интерсексы, причем
последняя группа - перспективнее для получения реверсантов. Из самок
должны получиться интерсексы, которых также можно будет
использовать для получения однополого потомства преимущественно
из самок, но забивая их при этом. При этом в выборке преобладали
интерсексы до 42,9%, что подтвердило предыдущий прогноз.
При окончании обработки форели метилтестостероном в выборке из
экспериментальной группы преобладали самцы до 33%, интерсексы
25% выборки и резорбирующиеся самки до 33,3% (как перспективные
интерсексы).
Результаты генетических исследований у молоди радужной форели.
Одновременно с отбором проб на гистологию у тех же экземпляров
молоди были отобраны биологические пробы для проведения
молекулярно-генетических исследований. В результате провед.нной
ПЦР-амплификации по локусу OmyY1 (см. Материал и методика)
(Иллюстрация 18) были выявлены 5 генетических самцов и
10 генетических самок. Продемонстрировано, что данная методика
позволяет на ранних стадиях онтогенеза на небольшой выборке
меченых особей выявлять потенциальных самцов и выбраковывать их
уже на стадии сеголетка. В августе были отобраны 16 особей форели из
экспериментального бассейна и 6 особей из контрольного бассейна для
гистологических и генетических исследований. Результаты
исследований по выявлению самок и самцов представлены на
иллюстрациях 19 и 20.
Таким образом, установлено, что у потенциальных генетических
самцов радужной форели на 100% амплифицируется локус OmyY1, то
есть среди молодых меченых особей мы можем точно отбраковать всех
генетических самцов (на 100%).
80
И
ллюст
рация
19.Гел
ь с
проду
ктами
ампли
фикац
ии по Y-специфическому локусу OmyY1 (792 п.о.) (августовские опытные пробы). М
– маркер молекулярного веса GeneRullerTM 100bpPlusDNALadder (Fermentas);
м – генетически мужские особи, ж – генетически женские особи
Иллюстрация 20.Гель с продуктами амплификации по Y-специфическому локусу
OmyY1 (792 п.о.) (августовские контрольные пробы). М – маркер молекулярного веса
GeneRullerTM 100bpPlusDNALadder (Fermentas);
м – генетически мужские особи, ж – генетически женские особи
Результаты сравнительного анализа рыбоводных показателей при
отработке методики реверсии пола у молоди радужной форели.
Результаты отлова молоди форели из бассейнов в рыбопитомнике
Иллюстрация 18. Гель с продуктами амплификации по Y-специфическому
локусу OmyY1 (792 п.о.) (июньские опытные пробы). М – маркер
молекулярного веса GeneRullerTM 100bpPlusDNALadder (Fermentas);
м – генетически мужские особи, ж – генетически женские особи
81
«Богушевский» показали, что в целом от посадки личинок
выживаемость молоди в опыте оказалась выше на 11,5%, по сравнению
с контролем. Биомасса, выловленной рыбы из опытных лотков
превышала контрольные величины на 113 кг. Число выловленной
молоди форели в опыте было достоверно больше, чем в контроле на
1294 экз. (Таблица VII)
Таким образом, введение гормона в корма для молоди форели в дозе
7 мг/кг при выращивании в лотках и бассейнах в двух хозяйствах в
течение 60 дней не привело к увеличению прироста массы и длины тела
по сравнению с контролем, однако величины конечной биомассы,
численности и % выживаемости опытной молоди оказалась достоверно
выше, чем для контрольной партии особей радужной форели.
Заключение
Изучено влияние андрогена (метилтестостерона) на рост, развитие и
реверсию пола у малька и сеголеток радужной форели при
выращивании в условиях УЗВ. Установлено, что при дозе препарата
7 мг/кг корма с экспозицией обработки рыб в течение 3-х месяцев у
молоди форели происходят изменения в гонадах, связанные с реверсией
пола с частотами от 25 до 42,9% от числа обследованных особей.
Форель, обработанная андрогенами, не отличалась от контрольных
особей по морфометрическим показателям. Выживаемость молоди в
опыте оказалась выше на 11,5%, чем в контроле даже в условиях
заболеваемости молоди ихтиофтириозом, а частоты морфологических
отклонений в опыте оказались ниже, чем в контроле, что
свидетельствует об отсутствии негативного влияния гормона на молодь
форели. Биохимические и гематологические показатели также не
выявили существенных отличий у особей в опыте и контроле.
Результаты молекулярно-генетических исследований по Y-
специфическому локусу OmyY1 у молоди форели позволяют
осуществлять эффективную прижизненную выбраковку самцов на
стадии сеголетка при небольших выборках особей и при условии
мечения.
Результаты гистологических и генетических исследований по
определению пола, проведенные на тех же экземплярах особей
сеголетков форели, полностью совпали.
82
Получены новые знания о возможностях модификации экспрессии
генома у лососевых рыб с помощью андрогенов в условиях УЗВ.
Разрабатывается методика прижизненной отбраковки самцов на
ранних стадиях онтогенеза у лососевых видов рыб, с использованием
молекулярно-генетических методов.
На примере радужной форели оценена роль андрогенов в росте и
развитии организма холодноводных видов рыб, а также реверсии пола
на стадии малька и сеголетка
Таблица VII. Результаты выращивания экспериментальной и контрольной партий
молоди форели на опытном корме в рыбопитомнике «Богушевский»
Вари-ант №
бассей-
на
Пло-
щадь,
м2
Посажено
малька
Средняя масса молоди, г Вариант №
бассейна
Площадь,
м2
начальная конечная
Экспери-
мент
6 28 11100 5.2+1.0 132.8+22.6 7727 69.6 1020.0
Контроль 7 28 11000 5.2+1.2 142.0+34.8 6387 58.1 907.0
Литература
ГКНТ СМ СССР, 1978. Унифицированные методы анализа вод СССР.
Ленинград, Гидрометеоиздат, 144 стр.
Лиманский В.В., Яржомбек A.A.,Бекина E.Н.,Андронников С.B.,
1984. Инструкция по физиолого-биохимическим анализам рыбы.
Москва, ВНИИПРХ, 58 стр.
Метальникова К.В., Бурцев И.А., Слизченко А.Г., 1989.
Методические рекомендации по получению однополого женского
потомства у стальноголового лосося. Москва, ВНИРО, 14 стр.
Метальникова К.В., Привезенцев Ю.A., 2010. Способ получения
многократно использованных реверсантов у рыб. Патент РФ №
2402203.
Паушева З.П.,1988. Практикум по цитологии растений. Москва,
Агропромиздат, 270 стр.
Правдин И.Ф., 1966. Руководство по изучению рыб. Москва, «Пищевая
промышленность», 376 стр.
Роскин Г.И., Левинсон Л.Б.,1957. Микроскопическая техника. Москва,
Государственное издательство «Советская наука», 489 стр.
83
Совет Министров Республики Беларусь, 2010. Об утверждении
Государственной программы развития рыбохозяйственной
деятельности на 2011–2015 годы. Постановление Совета Министров
Республики Беларусь 7 октября 2010 г., № 1453.
http://poseidon.by/content/20101007-ob-utverzhdenii-gosudarstvennoiprogrammy-
razvitiya-rybokhozyaistvennoi-deyatelnost; дата доступа:
20.01.2012.
Brunelli, J.P., Wertzler, K.J., Sundin, K., Thorgaard, G.H., 2008. Yspecific
sequences and polymorphisms in rainbow trout and Chinook
salmon. Genome, 51: 739-748.
Brunelli, J.P., Steele, C.A., Thorgaard, G.H, 2010. Deep divergence and
apparent sex-biased dispersal revealed by a Y-linked marker in rainbow
trout. Molecular Phylogenetics and Evolution, 56: 983-990.
Hisar, O., Yanik, T., Kocaman, E.M., Arslan, M., Slukvin, A.,
Goncharova, R., 2012. Effects of diludine supplementation on growth
performance, liver antioxidant enzyme activities and muscular trace
elements of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) juveniles at a low water
temperature. Aquaculture Nutrition 18 (2): 211-219.