Рекомендации по проведению компьютерного анализа качества сперматозоидов осетровых рыб


Основная функция сперматозоида состоит в активации яйца, побу-ждении его к развитию, а также в снабжении гаплоидным ядром. В связи с этим подвижность сперматозоидов является одним из важ-ных параметров. Основная роль в снабжении сперматозоида энергией принадлежит митохондриям, которые у рыб сконцентрированы в средней части сперматозоида.

С функциональной точки зрения под-вижность сперматозоидов напрямую зависит от уровня АТФ поэтому способность влияния на уровень АТФ может существенно изменить подвижность сперматозоидов. Сперматозоиды являются популярным биологическим объектом для оценки влияния факторов физической и химической природы на качество половых продуктов самцов. Так, уве-личение срока хранения спермы индейки наблюдалось при добавлении витаминов E и C, а введение цианокобаламина в криозащитную среду на начальных этапах криоконсервации спермы русского осетра повы-шало выживаемость и время движения сперматозоидов. Воздействие на сперму человека рентгеновским излучением угнетало, ультрафио-летовым не влияло, а инфракрасным излучением и электромагнитным полем повышало подвижность сперматозоидов. Воздействие гамма-
Температура, °С
Время от осеменения, мин
162
излучением на сперматозоиды крысы оказывало негативное влияние, а воздействие лазерным излучением красной области спектра повышало качество спермы индейки и собаки. Кроме того, воздействие на сперму тилапии светом белой, а также красной областей спектра при-водило к повышению подвижности сперматозоидов. Воздействие светом синей и ультрафиолетовой областей спектра оказывало отрица-тельный результат.
В ветеринарии и животноводстве много лет известны следующие методы оценки качества спермы животных: изучение анатомического строения сперматозоидов, объема эякулята, цвета, запаха, консистенции; оценка подвижности, густоты, интенсивности дыхания, резистентности, скорости обесцвечивания и др.
В животноводстве оценку спермы по подвижности проводят по де-сятибалльной системе. Наивысшую оценку – 10 баллов дают сперме в том случае, если все спермии обладают поступательным движением; при оценке в 9 баллов – 9 спермиев из 10 обладают прямолинейно-поступательным движением, 6 баллов – 6 из 10 и т. д. В рыбоводстве активность сперматозоидов выражают в баллах по шкале Персова, в которой за 5 баллов принимается быстрое поступательное движение всех спермиев; 4 балла – большинства спермиев, но в поле зрения встречаются отдельные сперматозоиды, осуществляющие замедленное зигзагообразное, круговое или колебательное движение; 3 балла – час-ти спермиев, причем преобладает замедленное зигзагообразное, круго-вое или колебательное движение, имеются неподвижные спермии; 2 балла – быстрое поступательное движение наблюдается редко, у час-ти спермиев колебательное движение, около 75 % спермиев непод-вижны; 1 балл – все спермии неподвижны.
Густота спермы, определяемая при глазомерной микроскопической оценке, дает приблизительное представление о количестве спермиев в 1 мл эякулята. Резистентность спермы выражается ко-личеством миллилитров 1%-ного раствора хлористого натрия, которое нужно добавить к 1 мл спермы, чтобы в ней прекратилось поступательное движение спермиев. Активность спермы оценивают по скорости обесцвечивания (восстановления) метиленовой синьки, смешанной со спермой. Подсчет сперматозоидов позволяет оце-нить число сперматозоидов с приемлемой изменчивостью из-за раз-бавления и подсчета ошибок до 6 % на 300 сперматозоидов при на-блюдении, когда подсчет 1:500 разбавленной спермы повторяется 3 раза. 163
Все вышеперечисленные методы являются достаточно субъективными, с большим процентом ошибок, который в значительной степени зависит от человеческого фактора.
С развитием высокоскоростной съемки и компьютерных техноло-гий стали возможны исследования движения одновременно несколь-ких клеток с определением траектории их перемещения и скорости. Использование аппаратно-программных комплексов для определения концентрации, характеристики движения сперматозоидов, а также морфологических критериев клеток легло в основу новой технологии в лабораторной медицине – CASA (computer-assisted semen analysis) – компьютерного анализа подвижности сперматозоидов. CASA позво-ляет проводить оценку таких показателей подвижности, как криволи-нейная скорость, прямолинейная скорость, линейность. Совокупное использование полученных данных позволяет дать объективную оценку качеству спермы и преодолеть субъективность интерпрета-ции, присущей стандартной спермограмме. Основное преимущество компьютерного анализа – это достоверное определение. В зависимо-сти от количества одновременно находящихся в поле наблюдения сперматозоидов компьютер рассчитывает параметры движения либо всех, либо большей их части, что невозможно при ручном производ-стве спермограммы. Другим важным преимуществом является вос-производимость, т. е. результат исследования не зависит от лаборан-та, производящего исследование, от уровня его подготовки, степени концентрации внимания или усталости. Можно быть уверенным, что проведенный одному пациенту анализ подвижности в разное время будет правильно отражать изменения показателей, исключая погрешности преаналитической стадии. Следующее преимущество – объективность: анализатор измеряет истинные скорости движения сперматозоидов, позволяя объективно судить о фертильности спермы. Совершен-ствование компьютерной морфологической диагностики позволяет по-лучить принципиально новую количественную информацию, недоступную врачу при обычном визуальном анализе изображений под микроскопом.
Простота получения, относительная доступность и массовость сперматозоидов животных и рыб делают их популярными объектами в биологических, ветеринарных и сельскохозяйственных исследованиях при изучении механизмов искусственного оплодотворения. Применение компьютерного анализа при исследовании качества спермы животных и рыб позволяет стандартизировать методику таких исследований и минимизировать субъективизм и человеческий фактор в процессе получе-ния новых научных результатов.
В большинстве случаев сперма, получаемая у рыб в условиях технологии искусственного воспроизводства, находится в неподвижном со-стоянии. Однако при добавлении обычной воды, в которой осуществляется выращивание и содержание рыб, сперматозоиды приобретают подвижность. Поэтому очень важно, в целях недопущения преждевремен-ной активации, в процессе получения половых продуктов у самцов рыб тщательно вытирать полотенцем или марлевой салфеткой анальный и хвостовой плавники, а также место у анального отверстия. При этом необходимо следить, чтобы в пробирку не попали вода, полостная жидкость или экскременты рыбы. Сперматозоиды ленского осетра перед активацией водой представлены на рис. 134.

Сперматозоиды ленского осетра перед активацией
Рис. 134. Сперматозоиды ленского осетра перед активацией
Подвижность сперматозоидов исследуют на тринокулярном (тип Зидентопфа) биологическом микроскопе проходящего света серии MMC-KZ-900 с независимой планахроматической оптической систе-мой на бесконечность F = 200 мм. Для анализа подвижности исполь-зуют счетные камеры с фиксированной глубиной марки Leja. Запись подвижности сперматозоидов осуществляуют с помощью видеокаме-ры MMC-31С12-M, построенной на основе сенсора компании Aptina. Частота кадров в секунду – 12 при разрешении 2048×1536, 60 – при 800×600, 95 – при 640×480, 135 – при 512×384. Для исследований ка-
165
чества спермы используют автоматизированное программное обеспе-чение ММС Сперм, которое представляло собой основу для компью-терного спермоанализатора (CASA). Оценка концентрации спермато-зоидов и анализ их подвижности производятся на видеоклипах в фор-мате AVI (захваченных в память компьютера или записанных на жест-кий диск) на основе алгоритма анализа с учетом требований руково-дства Всемирной организации здравоохранения.
В качестве анализируемых параметров используют следующие по-казатели, получившее распространение при исследовании подвижно-сти сперматозоидов человека в медицинских исследованиях: VCL – криволинейная скорость, мкм/с (усредненная по времени скорость движения сперматозоида вдоль его реальной траектории, как она вос-принимается в двухмерном пространстве под микроскопом); VSL –прямолинейная скорость, мкм/с (усредненная по времени скорость движения сперматозоида вдоль линии, проведенной между начальной и конечной точками траектории); VAP – средняя скорость движения по траектории, мкм/с (усредненная по времени скорость движения сперматозоида по усредненной траектории); WOB – колебание (вели-чина, описывающая колебание реальной траектории относительно ус-редненной, WOB = VAP / VCL); LIN – линейность (линейность реаль-ной траектории).
Для исследования подвижности сперматозоидов пробу разбавляют активирующей средой в соотношении 1:50. Состав активирующей сре-ды: 10 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2,10 мМ трис-HCl, рН 8,5. Для исследова-ний допускаются образцы, подвижность которых превышала 90 %. Для предотвращения прилипания сперматозоидов предметные стекла обрабатываются 1%-ным сывороточным альбумином. В каждом ви-деоклипе оцениваются от 20 до 70 сперматозоидов. Сперматозоиды со скоростью менее 3 мкм/с считают неподвижными и исключают из рас-чета подвижности. По результатам полученных данных определяют величину стимулирующего действия физических факторов на показа-тели подвижности сперматозоидов.
Схема траекторий подвижности сперматозоидов представлена на рис. 135.
 Показатели подвижности сперматозоидов ленского осетра
Рис. 135. Показатели подвижности сперматозоидов ленского осетра
Результаты апробации метода оценки подвижности сперматозоидов осетровых рыб в условиях аквакультуры с использованием современ-ных методов компьютерной диагностики представлены в табл. 21. В ре-зультате наших исследований было установлено, что средняя криво-линейная скорость сперматозоидов (VCL) ленского осетра составила (173,37 ± 1,59) мкм/с, средняя прямолинейная скорость (VSL) –(164,19 ± 1,82) мкм/с, а средняя скорость движения по траектории (VAP) – (171,22 ± 1,20) мкм/с. Такой подробный анализ подвижности, в случае необходимости оценки массового количества сперматозоидов от племенных производителей рыб, позволяет формировать сперму по категориям подвижности, выделяя пробы с быстрым и прямолиней-ным движением, с медленным прямолинейным движением, с непрямо-линейным движением и пробы с полностью неподвижными спермато-зоидами. При этом появляется возможность выявлять умершие или умирающие «от старости» сперматозоиды на фоне здоровых, «моло-дых» сперматозоидов.
Таблица 21. Результаты измерений подвижности сперматозоидов осетровых рыб с использованием автоматизированного программного обеспечения ММС Сперм

Результаты измерений подвижности сперматозоидов осетровых рыб с использованием автоматизированного программного обеспечения ММС Сперм


В наших исследованиях мы также определяли продолжительность подвижности сперматозоидов и зависимость средней криволинейной скорости от времени после активации водой (рис. 136).

Зависимость VCL от времени после активации водой
Рис. 136. Зависимость VCL от времени после активации водой
Как видно из данных, представленных на рис. 136, максимальные показатели средней криволинейной скорости у ленского осетра на-блюдаются в первые 30 с после активации водой. Данный показатель стремительно падает уже к 90 с после активации. После 90 с в наших исследованиях наблюдалось значительное уменьшение показателя VCL, а затем полное прекращение подвижности. Аналогичная зави-симость от времени после активации наблюдалась при изучении по-казателя процента (доли) подвижных сперматозоидов. Поэтому в про-цессе искусственного оплодотворения икры ленского осетра (и в це-лом осетровых) очень важно соблюдать четкую последовательную технологическую цепочку и не допускать медлительности в действи-ях, начиная с момента запуска (разбавления спермы) до момента до-бавления осеменяющего раствора к икре. Наши результаты показы-вают, что длительное осеменение икры (более 90 с) нецелесообразно, так как возможность успешного оплодотворения икры резко снижа-ется. Учитывая высокую клеящую способность икры, которая насту-пает уже через 3–5 мин после оплодотворения, передержка икры в осеменяющем растворе опасна в связи с тем, что может вызвать
Время после активации, с
VCL, мкм/c
168
преждевременное приклеивание икры к поверхности осеменяющей емкости.
Для компьютерного анализа используют программу ImageJ, кото-рую можно скачать по веб-ссылке: http://imagej.nih.gov/ij/download/ win32/ij148-jdk6-setup.exe или на сайте: http://imagej.nih.gov/ij/.
После установления открываем программу ImageJ:

После установления открываем программу ImageJ:


File / Open – открываем рисунок со специальной калибровочной шкалой для микроскопов, которая заранее фотографируется камерой микроскопа с использованием рабочего увеличения записи видеороликов.
Снимок калибровочной шкалы важно делать в разрешении, одинаковом с разрешением видеоролика подвижности сперматозоидов.

Снимок калибровочной шкалы


Далее выбираем инструмент Straight Line.

Далее выбираем инструмент Straight Line.
Измеряем шкалу деления в длину. Для точности измерений рисунок увеличиваем.

Измеряем шкалу деления в длину. Для точности измерений рисунок увеличиваем.
170
Далее данную длину необходимо откалибровать. Выбираем сле-дующее:

Далее данную длину необходимо откалибровать. Выбираем сле-дующее:
171
В графе Known distance (Известная дистанция) указываем значение 10. В графе Unit of length (единица измерения длины) указываем зна-чение μm (микрометр). В строке Global необходимо поставить галочку для того, чтобы данные калибровки сохранялись при последующих измерениях. Значения калибровки подходят только для данного при-мера. Точное значение калибровки зависит от вида используемой ка-либровочной шкалы.

Точное значение калибровки зависит от вида используемой ка-либровочной шкалы.
Далее открываем в программе ImageJ исследуемый видеоролик.

Далее открываем в программе ImageJ исследуемый видеоролик.

172
В меню видеоролика (внизу) стрелкой вправо проматываем ролик на 5 кадров. Информация о количестве кадров находится вверху роли-ка. Копируем изображение с ролика. Создаем новое изображение.

Информация о количестве кадров находится вверху роли-ка. Копируем изображение с ролика. Создаем новое изображение.
173
Разрешение изображения создаем одинаковое с разрешением видео-ролика. В данном примере – 640×480. В открытое новое поле вставляем скопированное изображение.

В открытое новое поле вставляем скопированное изображение.
174
Слева видеоролик, справа начальное (с 5-го кадра) изображение – фото с видео.
Начинаем исследования. Для этого необходимо выбрать инструмент Multi-point.
Справа выбираем сперматозоид, за которым будем наблюдать.

Справа выбираем сперматозоид, за которым будем наблюдать.
175
Выбираем инструмент Segmented Line.
В левом окне ставим курсор на выбранный сперматозоид, кликаем мышью (т. е. начинаем измерения).

В левом окне ставим курсор на выбранный сперматозоид, кликаем мышью (т. е. начинаем измерения).
176
Не отводя курсор от сперматозоида, нажимаем клавишу «/». Данная клавиша запускает и останавливает видеоролик. Запускать и останав-ливать его необходимо очень быстро. После остановки видеоролика необходимо отметить точку перемещения сперматозоида, тем самым прорисовывая его траекторию.

После остановки видеоролика необходимо отметить точку перемещения сперматозоида, тем самым прорисовывая его траекторию.
Необходимо быть очень внимательным, так как некоторые сперма-тозоиды перемещаются очень быстро, а некоторые – медленно. Проце-дуру запуска/остановки видеоролика и рисования траектории сперма-тозоида производят до момента выхода исследуемого сперматозоида из обзора, измерения прекращают также в том случае, если спермато-зоид медленно двигается. Измерения в сегментированной линейке ос-танавливают нажатием правой кнопки мыши с последующим нажати-ем клавиши «М» (в английской раскладке). Далее появляется меню с измерениями, где значение 32,155 в колонке Length дает информацию о длине пройденного пути одним сперматозоидом в микрометрах (μm), а значение 6,94 s – о времени, потраченном на прохождение данной дистанции в секундах.

о времени, потраченном на прохождение данной дистанции в секундах.

177
Далее видеоролик возвращается на пятый кадр и осуществляется аналогичная процедура измерения с другими сперматозоидами.

Далее видеоролик возвращается на пятый кадр и осуществляется аналогичная процедура измерения с другими сперматозоидами.
На примере, указанном сверху, справа точки с исследуемыми спер-матозоидами (в данном примере их 10, в исследованиях должны быть отмечены все), слева траектории на видео. Траектории не сохраняются. Каждый раз рисуется новая траектория. В графе результатов накапливаются следующие сведения:

В графе результатов накапливаются следующие сведения:
178
Результаты могут легко экспортироваться в другие программы для последующей статистической обработки.